家畜精液质量相关生物标记的研究进展

甄林青，王立蕊，付杰丽，李玉华，李新红

(上海交通大学农业与生物学院，上海市重点兽医实验室，上海 200240)



家畜精液质量相关生物标记的研究进展

甄林青，王立蕊，付杰丽，李玉华，李新红*

(上海交通大学农业与生物学院，上海市重点兽医实验室，上海 200240)

摘要：精液质量评估是预测家畜繁殖能力的主要手段，而精液中相关生物标记蛋白是决定受精潜能的物质基础。随着蛋白质组分析技术的逐步发展，发现家畜精子中与繁殖力相关联的生物标记，直接或间接影响受孕率及产仔数。这些标记蛋白的发现与鉴定，使得通过定向育种来提高繁殖性能成为可能，同时为评估公畜不同亚种之间的繁殖差异性提供理论依据。本文对近期公畜繁殖能力相关的精子生物标记蛋白的研究进展进行综述。

关键词：家畜；精子；蛋白质组学；生物标记；繁殖

家畜精子从精母细胞分化为成熟精子，到与卵细胞结合过程中要经历一系列复杂生理生化过程，才能保证精子成功受精。人工授精技术在家畜动物繁殖生产中广泛应用，精液质量检测成为家畜动物繁育的重点。传统精液质量检测主要包括精子形态学、运动能力等宏观指标，而这些指标并不能精确反映精子受精能力及受精后的胚胎发育能力[1]。多年来，受孕率[2]及产仔数[3-4]等由多基因调控的数量性状相关遗传学研究备受关注，研究重点主要集中在母畜受胎率及产仔数等繁殖性状。随着蛋白质组学分析技术的成熟，定量蛋白质组学得到长足发展，这些技术为揭示家畜动物精子发生机制、筛选影响精子受精能力关键蛋白、预测家畜繁殖能力提供了理论依据，使得高效的种公畜预测及筛选体系成为可能。近年来，相继报道证实家畜动物精子中含有多种直接影响受精率及产仔数的繁殖相关生物标记蛋白[5-7]，这些标记蛋白直接影响产仔数，为探索繁殖性状调控机制以及遗传学相关研究开启新的研究领域。家畜动物精子中繁殖相关标记蛋白主要包括精子结构蛋白、能量相关蛋白、运动相关蛋白、获能调控蛋白、精卵结合相关蛋白等[8]。本文以IPA数据库中繁殖关联蛋白为基础，结合特定蛋白发掘鉴定技术方法，对家畜动物繁殖相关生物标记蛋白的最新研究进展进行阐述，以期为开发雄性家畜繁殖力预测及诊断的新方法，准确评估重要经济家畜种类的繁殖性能，对快速提高后代产仔数及繁殖性状提供新思路。

1精子蛋白

对哺乳类动物精子(人、牛、马、猪、羊等)进行蛋白质组研究，发现存在繁殖相关蛋白。这些蛋白多为鞭毛结构相关蛋白、能量相关蛋白、功能相关蛋白(如精子运动、获能、精卵融合相关蛋白)[9-11]。同样，利用蛋白质二维电泳鉴定技术及生物信息学分析研究发现，家畜动物精子中存在与产仔数直接相关的生物标记蛋白，这些蛋白亦包括结构、能量及功能相关蛋白[12]。

1.1精子运动及结构相关蛋白

最早研究精子繁殖关联蛋白时，常用基因敲除的技术方法。通过敲除某些基因后，检测精子的运动能力及受精能力，从而证实精子中结构蛋白以及肌动蛋白的组成直接影响精子运动能力。例如研究发现，外周致密度蛋白(Outer dense fiber protein，ODF)ODF2+/-型小鼠其精子鞭毛发育有严重缺陷且表现为不育[5]。而猪、牛、马家畜动物精子中ODF作为鞭毛脚架蛋白主要构成成分，对精子分化有重要作用，并与精子运动能力呈正相关[9-10，13]。X.Chen等[10]比较猪的鲜精及冻融后精子的蛋白质组发现，ODFs、微管蛋白及轴丝排列无序并发生形态改变。与基因敲除技术相比较，A.Swegen等[13]运用生物信息学方法研究证实，马精子中ODF2与精子繁殖能力呈正相关。同样Y.L.Huang等[9]以运动能力不同的水牛精子为试验材料证实，ODF2表达量与精子运动能力呈正相关，在强运动能力精子中高表达，预示着家畜精子中ODF2可作为繁殖相关性标记蛋白。与ODF2相类似，蛋白激酶A锚定蛋白4(A-kinase anchor protein 4，AKAP4)作为纤维鞘的主要蛋白成分，仅在精子细胞中表达，该蛋白可特异性结合蛋白激酶A(Protein kinase-A，PKA)将其锚定于纤维鞘，调节精子鞭毛主段蛋白磷酸化，通过cAMP/PKA信号通路调节精子获能及超激活运动。J.M.Teijeiro等[6]认为AKAP4参与猪精子纤维鞘的形成，直接参与猪精子顶体反应。AKAP4基因敲除后，小鼠精子鞭毛较短且不能形成纤维鞘，导致精子运动能力缺失[14]。由此提示AKAP4蛋白活性与精子的运动能力呈正相关，直接影响家畜的受精率。此外，ODF等结构蛋白以及AKAP4等激酶蛋白的磷酸化修饰直接影响精子的活力及受精率[15]。

在哺乳动物中，精子相关抗原6蛋白(Sperm-associated antigen 6，SPAG6)主要集中在轴丝中心粒上，通过中心体调节纤毛和鞭毛的运动能力，在纤毛的形成、轴丝的方向以及细胞极性中也起到重要作用[16]。在精子中SPAG6位于精子鞭毛上，对精子鞭毛的运动至关重要，它可能作为骨架蛋白来维持精子鞭毛结构的完整性。缺少SPAG6的雄鼠表现为不育，其精子有明显的运动障碍、精子鞭毛结构紊乱[17]。A.Swegen等[13]利用生物信息学方法对马精子SPAG6进行GO分析，发现该蛋白参与抗精子免疫不育过程，并可作为避孕疫苗的靶蛋白。因此，SPAG6亦可作为预测精子繁殖能力的生物标记蛋白。本实验室利用iTARQ标记定量蛋白质组学技术定量比较梅山猪与杜洛克猪精子蛋白质组成差异发现，两个品种精子SPAG6存在较大差异性(数据尚未发表)，预示两种猪精子的繁殖生物学特性存在一定差异性。另外，存在于家畜动物精子鞭毛主段的CatSper离子通道蛋白，其活性与精卵融合及受精作用呈正相关性[18-19]。运用基因敲除技术以及生物信息学方法能够快速发掘精子中与受精相关的蛋白，但在产仔数相关性方面没有直接的证据，尚需要进一步验证。

1.2能量代谢相关蛋白

1.2.1葡萄糖代谢途径在哺乳动物精子中，多种直接参与精子代谢并调控ATP合成的酶类，被证实是家畜动物繁殖相关生物标记蛋白。如位于精子鞭毛主段的筒状纤维上的S-甘油醛-3-磷酸脱氢酶(S-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDHS)是糖酵解和糖异生代谢途径产生的特异性酶，催化甘油醛-3-磷酸形成甘油酸-1，3-二磷酸，进而生成产生与精子运动所需ATP，且雄鼠GAPDHS基因敲除后会产生非运动型精子[20]。磷酸丙糖异构酶(Triosephosphate isomerase，TPI)作为糖酵解过程的关键酶，直接参与精子获能及顶体反应过程。研究证实弱精症精子及耐冻能力较差的精子中TPI含量要明显高于正常精子[21-22]，低产仔数的猪精子中TPI表达量较高，可能是高浓度TPI会过早诱发精子获能反应，从而降低精子受精能力。因此TPI可作为家畜动物繁殖相关性生物标记蛋白[7]。在糖酵解过程中，烯醇酶(Alpha-enolase-like，ENO1)催化2-磷酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇式丙酮酸，调控ATP合成，且ENO1活性直接影响ATP的生成量。成熟精子尾部糖酵解产生的丙酮酸，直接由ENO1运送到线粒体内并参与三羧酸循环能量代谢过程[23]。A.A Moura等[24]在牛精清蛋白中也鉴定到ENO1，并推测与精子繁殖能力呈正相关，可能参与细胞膜重塑、脂质转运、精子保护、避免精子过早发生顶体反应等生物过程。乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase C chain，LDHC)仅存在于成熟睾丸和成熟精子细胞中，无论是LDHC活性，还是其自身含量均与家畜动物精子超激活运动、蛋白磷酸化以及穿过透明带等繁殖能力呈正相关[25]。当缺少LDHC时，细胞糖代谢受阻导致ATP生成量减少[26]。F.Odet等[27]进一步研究证实LDHC缺失导致精子细胞糖代谢水平明显降低，ATP生成量及精子活力明显降低。LDHC对维持精子鞭毛糖代谢及ATP的生成起到关键作用，对雄性繁殖能力及精子功能有重要影响。此外，马精子蛋白生物信息学分析结果显示，该蛋白被证实与抗精子免疫不孕密切相关[13]。因此，LDHC为特殊性家畜动物精子繁殖相关生物标记蛋白。

1.2.2氧化磷酸化代谢途径维持哺乳动物精子运动及其他生理过程的能量除糖代谢生成的ATP外，主要来自于线粒体的氧化磷酸化，此过程需要相应的酶辅助完成。近年研究证实，3种氧化磷酸化代谢辅助酶具有繁殖相关生物标记特性，其中两种与家畜动物繁殖率呈正相关性，一种具有负相关性。ATP合成酶α亚基(ATP synthase subunit F，ATP5A1)是位于线粒体外膜的一种关键酶，通过呼吸电子传递链催化ADP形成ATP，是与家畜动物繁殖效率呈正相关的生物标记蛋白。Y.L.Huang 等[9]研究表明，运动能力较强的水牛精子中ATP5A1表达量明显高于低运动能力精子。苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase，MDH)是细胞呼吸作用的关键蛋白，在线粒体内的转运是草酰乙酸回补反应的主要途径之一，对细胞能量代谢有重要作用。在羊、猪、水牛等哺乳动物精子中，MDH仅位于鞭毛中段。且在冷冻牛精子中，MDH有利于精子的获能和顶体反应[28]。与基因敲除以及生物信息学方法不同，W.S.Kwon等[7]利用二维电泳技术，对产仔数有差异的猪精子蛋白进行质谱鉴定分析及ELLSA验证发现，MDH2在高产仔数精子中表达量较高，与精子产仔数呈正相关。同时报道，NADH脱氢酶-泛醌-硫铁蛋白2(NADH dehydrogenase-ubiquinone-iron-sulfur protein 2，NDUFS2)在低产仔数精子中表达量较高，与产仔数呈负相关。实际上，NDUFS2参与电子传递链酶复合体Ⅰ铁硫蛋白亚基(IP)的形成，构成酶复合体Ⅰ催化中心，是NADH泛醌氧化还原酶亚基，对猪NDUFS2基因的研究结果表明，该基因与能量的产生和转化功能密切相关[29]。研究表明，在马精子中NDUFS2参与精子氧化损伤这一生物过程[13]。因此，对于该蛋白是如何调控精子繁殖能力仍需深入研究。尽管二维电泳技术在蛋白鉴定方面存在一定的局限性，极端分子量蛋白以及质谱本身均可能致使蛋白遗漏或者出现假阳性，但该研究结果首次报道了精子蛋白与产仔数的直接相关性。

1.3获能过程中信号通路关键蛋白

1.3.1Ca2+信号通路蛋白哺乳动物精子获能以及超激活运动均与细胞内Ca2+浓度密切相关，因此Ca2+级联信号通路是调节精子运动的主要方式。钙调蛋白(Calmodulin，CALM)是最常见的一种钙离子绑定蛋白，是一个多功能中间信号蛋白，通过结合Ca2+后调节多种蛋白间的反应。在家畜动物精子细胞中，CALM位于精子顶体及鞭毛部分，对顶体反应及精子运动及超激活运动都有至关重要的作用。A.A.Moura等[24]认为CALM可转运亲脂性物质，促进细胞膜重塑，以保护牛精子避免过早发生顶体反应。最新研究证实，人工授精后产仔数不同的猪精子间CALM表达量不同，其含量与产仔数呈正相关[7]。此外，CALM蛋白激酶2(Calmodulin kinase 2，CALMK2)也参与精子获能、顶体反应发生[30]以及精子运动[31]，而CALMK2的活性又与细胞内CALM浓度有关。成熟马精子中，L型Ca2+压力通道，主要存在于精子颈部及鞭毛主段，对精子的生理和繁殖有十分重要的作用[32]。CatSper离子通道被激活后，大量Ca2+内流使细胞内Ca2+浓度升高，从而引发一系列有序的生理活动，对精子获能并完成受精作用至关重要。有研究发现，Catsper1 mRNAs表达量与精子繁殖能力有关，如Catsper1 mRNAs在高密度的马精子细胞中表达量较低，在一定程度上说明精子本身密度与繁殖能力存在相关性[33]，但其与产仔数之间的相关性尚需进一步验证。

1.3.2PKA信号通路蛋白在许多哺乳动物精子中已经发现丝氨酸/苏氨酸磷酸化和酪氨酸磷酸化，其中多数蛋白底物的酪氨酸磷酸化都与获能相关，所以也把蛋白酪氨酸的磷酸化作为精子获能的标志性分子事件。大量研究表明，cAMP/PKA信号通路是调节精子蛋白酪氨酸磷酸化最主要的上游信号通路[34]。PKA能够磷酸化蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基，激活蛋白激酶、抑制蛋白磷酸酶，最终增加酪氨酸磷酸化。尽管cAMP-PKA信号通路相关蛋白没有直接证实与家畜动物产仔数的相关性，但缺少PKA催化亚基的小鼠精子表现出形态异常及运动异常等不育特征[35]。此外，精子细胞内Ca2+级联信号通路与cAMP/PKA信号通路间存在一定关联性，可相互影响[35]。

1.3.3其他参与信号通路调节的蛋白在精子细胞中载脂蛋白(Apolipoprotein A-I，APOA1)可以引起胆固醇外流，调控精子细胞的多个信号通路，从而影响精子超激活运动及精子的获能。如在牛精子中，APOA1作为高密度脂蛋白的一部分，不仅可以调节亲脂性物质转运，还可促进细胞膜重塑，调节精子顶体反应的发生[24]。W.S.Kwon等[36]研究表明，APOA1可能存在于成熟精子中，其活性及含量与繁殖率呈负相关。另外，睾丸离子通道蛋白(Voltage-dependent anion channel 3，VDAC)是位于线粒体外膜的完整膜蛋白。K.D.Hinsch等[37]研究首次从牛精子中分离出VDAC2，发现该蛋白参与细胞能量代谢，调节牛精子运动能力及繁殖性能，可能是VDAC多肽形成的孔道允许ATP和ADP小分子通过，调控ATP/ADP的跨膜交换，从而调节细胞能量代谢[38]。

1.4顶体反应及精卵融合过程中关键蛋白

胞浆5′-核苷酸酶1B亚基(Cytosolic 5′-nucleotidase 1B isoform 2，NT5C1B)位于精子顶体前区质膜外围纤维壳上，参与顶体反应并调节精子的运动能力[39]，在精卵结合过程中起到关键作用。W.S.Kwon等[7]利用二维电泳技术证实，NT5C1B在猪高产仔数精子中具有高表达特性，其含量与猪产仔数呈正相关，具有明显繁殖相关生物标记特性。同时发现猪精子中赤道蛋白(Equatorin，EQTN)含量与产仔数呈负相关，即产仔数较低精子中EQTN表达量较高。前期的研究报道证实，Eqtn基因敲除型小鼠精子虽然有正常的精子形态和运动能力，但不能完成顶体反应和受精作用[40]，尽管利用二维电泳技术鉴定的差异蛋白可能存在一定的疑问，但是两种方法鉴定到的结果具有同一性。在精子获能过程中，RAB2A蛋白(Ras-related protein，RAB-2A)参与顶体反应过程中顶体结构的改变，调控囊泡运输和膜融合[11]。同EQTN繁殖相关性类似，顶体形成相关蛋白RAB2A在低产仔数精子中表达量较高，与繁殖能力呈负相关[7]。另外，受精素(Fertilin)对精子膜蛋白在附睾中成熟起到关键作用，也使得受精素成为精子成熟的分子标记之一[41]，但其是否与产仔数之间存在直接关联性还有待进一步研究。

1.5核蛋白

哺乳动物精子核蛋白繁殖相关性研究尚未普遍关注。在精子发育过程中，精子细胞中的组蛋白逐渐被鱼精蛋白替代，鱼精蛋白1和鱼精蛋白2家族成员(P2、P3和P4)是精子细胞中表达量最多的核蛋白，有利于染色质固缩并保持DNA完整性。研究发现在不育精子中，组蛋白2B表达量过高，而鱼精蛋白表达量降低[42]，细胞中DNA碎片增多，从而影响精子受精能力[43]。家畜动物精子与繁殖相关联的核蛋白研究较少，这亦是未来研究的重点方向。

2精清蛋白

家畜动物精清的主要成分是睾丸、副性腺和附睾的分泌物，内含多种影响精子繁殖能力精清蛋白。目前研究证实，牛、马、猪等多种家畜动物部分精清蛋白黏附在精子表面[44]，不仅防止精子受到损伤、维持精子寿命，而且在精子获能及受精过程中同样起重要作用[45]。如山羊精清蛋白可刺激精子鞭毛，促进精子运动[46]。而有些蛋白则直接影响家畜动物的受胎率及产仔数，因此精清蛋白具有繁殖相关生物标记特性。

精子粘附素是一种多功能蛋白，能维持细胞膜的稳定性，调节精子与输卵管的相互作用、调节精子获能及精卵融合过程[47]。在猪精液中约有90%以上的蛋白属于精子粘附素蛋白家族，如AQN-3和AWN属于ZP-结合蛋白覆盖在精子的表面，在调控猪精子顶体反应和精卵识别融合过程中起重要作用。W.S.Kwon等[7]运用蛋白质二维电泳技术研究发现AQN-3和AWN两种黏附素蛋白在低产仔数的猪精子中含量较高，证实AQN-3 和 AWN两种蛋白与猪产仔数呈负相关，其原因可能是高含量的AQN-3和AWN阻碍精子在输卵管内运动，影响猪精子获能及精卵识别过程。

精清糖蛋白(Major seminal plasma glycoprotein，PSP)如PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ，具有免疫调节活性[45]，可延迟精子发生似获能变化，对延长精子寿命有重要作用[47]。然而，研究证实该蛋白与猪产仔数呈负相关，当PSP蛋白含量过多或精子长时间与PSP蛋白接触可能会降低其繁殖能力[48-49]。其原因可能是PSP-Ⅰ蛋白(22 ku)在精子体外保存过程中会降低精子的运动能力及穿卵能力。而骨桥素(Osteopontin，OPN)蛋白是与高繁殖能力相关的精清蛋白，添加OPN可以降低多精入卵率，有利于体外受精后胚胎的发育[50]。另外，谷胱甘肽过氧化物酶(Epididymal secretory glutathione peroxidase，GPX-5)不仅为精子成熟提供有利环境[51]，还可以保护精子细胞膜、避免氧化物损伤，对产仔数和生育指数有促进作用。正常个体与不育个体精清蛋白质中同样存在差异，这对于揭示不同个体繁殖差异性及繁殖相关蛋白分子生物标记有重要意义。

3总结与展望

通过发掘家畜动物精子繁殖关联性生物标记蛋白，探讨影响家畜动物多产性能的遗传因素，使利用精子选择育种来提高繁殖性能成为可能，同时为评估公畜不同亚种之间的繁殖差异性提供理论依据，对家畜饲养业发展起到很大的促进作用。研究显示，家畜动物精子繁殖力相关联蛋白研究主要集中在运动能力以及受精效率等过程，而受精卵着床率、胚胎发育以及成活率等发育环节研究较少，缺乏精子与胚胎发育及成活率具有关联性的蛋白。理论上，受胎率、产仔数等繁殖数量性状是由多种基因调控，不同基因调控不同繁殖过程。因此繁殖性能不局限于受精率，还涉及胚胎发育过程及产后个体的成活率，其中胚胎成活率及发育过程对于繁殖力的高低极为重要。某些蛋白如何控制繁殖率的机制尚需深入研究，尤其是与产仔数相关联的蛋白如何影响产仔数的机理也有待进一步研究。部分家畜动物精子繁殖关联蛋白研究仅局限于影响高繁殖性能的某个环节，只有少数精子单一蛋白来分析繁殖性能的关联性及遗传机制，此方面亦是未来研究的重点。

另外，蛋白翻译后修饰是调控精子细胞生理功能的主要方式，目前精子蛋白翻译后修饰研究较多的是磷酸化修饰，而对精子全蛋白乙酰化修饰、琥珀酰化修饰研究较少，尤其是精子组蛋白酰化修饰、磷酸化修饰以及甲基化修饰如何调控精子受精、受精卵分化以及胚胎发育等多种生物学过程，家畜动物精子繁殖关联性生物标记蛋白的修饰研究亦是未来研究的重点。此外，已有研究报道主要应用基因敲除以及蛋白质二维电泳技术方法来分析鉴定某些差异蛋白，结合生物信息学来分析预测某些特定蛋白的功能。然而，上述技术方法均具有一定的局限性，尤其是二维电泳技术在试验操作、极端分子量蛋白以及质谱分析鉴定层面均可能产生蛋白鉴定以及蛋白定量偏差，因此，在蛋白定量分析层面尚需进一步完善技术。随着定量蛋白质组学以及蛋白修饰组学技术的不断发展，二维电泳与标记定量蛋白相结合技术手段将广泛应用于家畜动物精子繁殖相关性生物标记蛋白以及相关修饰调控研究。

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(编辑程金华)

The Research Progress in Semen Quality Related Biomarker in Livestock

ZHEN Lin-qing，WANG Li-rui，FU Jie-li，LI Yu-hua，LI Xin-hong*

(ShanghaiKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology，SchoolofAgricultureandBiology，ShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200240，China)

Abstract:The evaluation of semen quality was the primary method of predicting livestock fertility ability and the fertility related protein markers in semen were the basic materials to determine the potential of fertilization.With the development of proteomic technology，an increasing number of biological markers related to sperm fertility were found in livestock，which affected both the pregnancy rate and the litter size directly or indirectly.The discovery and identification of these protein biomarkers made it possible to improve reproductive performance through directive breeding，and provided theoretical basis for the prediction of sperm fertility difference between subspecies of sire.The research progress in semen protein biomarkers related to reproduction in male livestock was summarized in this article.

Key words:livestock；sperm；proteomics；biological markers；fertility

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.002

收稿日期：2015-10-08

基金项目：上海市科技兴农重点攻关项目(沪农科攻字( 2014 )第7-2-5 号)

作者简介：甄林青(1991-)，女，河北保定人，硕士生，主要从事动物繁殖生物技术研究，E-mail：zhenlinqing91@126.com *通信作者：李新红，副教授，E-mail：lixinhong7172@sjtu.edu.cn

中图分类号：S82；S814.1

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)04-0645-07