PCR-DGGE技术在废水生物处理中的应用

武振兴

(秦皇岛经济技术开发区环境监察大队, 河北 秦皇岛 066000)



PCR-DGGE技术在废水生物处理中的应用

武振兴

(秦皇岛经济技术开发区环境监察大队, 河北 秦皇岛 066000)

摘要：变性梯度凝胶电泳( PCR- DGGE)具有可靠性强、重复性好、方便快捷等优点，目前被广泛地应用于废水生物处理环境微生物群落多样性和动态分析。本文对PCR- DGGE技术的基本原理和流程，图谱的优化过程和图谱分析方法，及其在环境微生物生态学中的应用进行了综述，并对该技术自身存在的局限性和应用前景进行了评价。

关键词：PCR；DGGE；微生物分析

1PCR-DGGE基本原理与方法

1.1PCR-DGGE的基本原理

DNA分子双螺旋结构是由氢键和碱基的疏水作用共同作用的结果。温度、有机溶剂和pH等因素可以使氢键受到破坏，导致双链变性为单链。DGGE技术检测核酸序列是通过不同序列DNA片段在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化，导致电泳速度的急剧下降,最后在其相应的变性剂梯度位置停滞，经过染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带。该技术可以分辨具有相同或相近分子量的目的片段序列差异，可以用于检测单一碱基的变化和遗传多样性以及PCR扩增DNA片段的多态性[1]。该技术首先从复杂微型生物集合中提取基因组DNA，用特异性引物(如16SrRNA基因和18SrRNA基因)进行PCR扩增，混合的PCR产物在变性剂线性梯度变化的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，相同大小不同序列的DNA 片段将停留在凝胶的不同位置，以达到分离混合PCR产物的目的。

1.2PCR-DGGE的流程

PCR-DGGE的基本流程是(1)首先从各种不同环境中取得环境样品；(2)进行环境样品宏基因组DNA的提取及纯化；(3)通过聚合酶连锁反应PCR将提取的宏基因组DNA中的特定序列如16SrDNA和18SrDNA进行扩增；(4)进行预实验，优化DGGE条件；(5)制胶；(6)扩增产物利用DGGE进行分离；(7)DGGE图谱分析；(8)对DGGE条带进行测序并鉴定分析；(9)鉴定群落成员。

2PCR-DGGE技术在废水生物处理中的应用

PCR-DGGE技术解决了传统方法的片面性，在分析各种环境微型生物群落多样性和动态性方面得到了广泛应用。于水利等，利用PCR-DGGE方法对3个不同碳源供应的反应器内细菌多样性进行分析，发现以污水为碳源的反应器内细菌多样性要优于葡萄糖碳源和乙酸钠碳源的反应器[2]。张丹等采用变性梯度凝胶电泳检测技术对硝化菌群的的特异性扩增产物进行了分析，发现限氧自氧硝化一反硝化生物脱氮系统中氨氧化菌和亚硝酸氧化菌随溶解氧的降低表现出了不同的种群变化规律，氨氧化菌种群多样性受溶解氧的影响非常大，而亚硝酸氧化菌的种群多样性比较单一，且不受溶解氧的影响[3]。

陈桐生等，以PCR技术扩增基因的V3可变区，结合应用双梯度变性梯度凝胶电泳这一技术，分析除臭生物滤池中不同空间层次的微生物种群的基因多样性，及富集前后微生物种群结构的变化，以期了解可培养细菌的情况，对主要片段进行序列分析。发现在滤池的不同层次上呈现出明显的空间分布多样性差异，并且培养前后及不同培养基富集。培养的微生物种群的多样性及特异性有很大的差别。序列比对显示，硫氧化细菌在除臭过程中占有优势地位[4]。

王晓丹等在对北京翠湖湿地污水塘、 表流湿地和潜流湿地3 个单元的PCRDGGE分析中发现，北京翠湖表流和潜流湿地改变了水体中总的微生物数量及可培养的细菌数量，随着湿地单元的逐级处理,总的微生物数量呈逐渐上升趋势，且表流和潜流湿地处理改变了水体中细菌的优势群落结构，发现了某些可能对水质造成危害的类群[5]。

Moura等采用16S rDNA的DGGE技术，分析了2个污水处理厂曝气池中微生物菌群的变化，DGGE图谱显示，在春冬和夏秋季节收集的样品中，微生物的变化很大，温度、 pH、 溶解氧(DO)等因素均能影响微生物群落的结构，并进一步确定了所研究样品中的主要微生物种群[6]。孙宝盛等在实际工程中比较了用膜生物反应器( MBR)处理不同水质后微生物的DGGE 图谱，分析了不同MBR中微生物群落多样性的特点，结果表明，不同水质条件的MBR 在长期稳定运行后，形成了各自特定的生态群落结构，既有共同的优势种群，也有因水质的不同经过长期演替而产生的各自的种群[7]。张洪军等在研究A/ O工艺膜生物反应器处理生活污水的脱氮特性时，采用了PCR-DGGE技术,发现随着系统时间的延长，硝化细菌的数量逐渐增加，并且不同菌种的丰度也发生了变化[8]。

荷兰Delft大学Sliekers等[9]应用分子生物技术发现CANON工艺中可能存在三种微生物：类亚硝化单胞菌的好氧氨氧化菌、类浮霉状菌的厌氧氨氧化菌以及氧化亚硝酸盐的硝化菌和硝化螺菌，并分析了它们在系统中的相互反应与竞争关系。Egli等[10]人则分析了生物膜CANON工艺的生物构成和基质代谢的途径。董远湘[11]等人用PCR-DGGE技术对OLAND中硝化阶段不同时期的生物膜中微生物的种群动态变化进行了分析。研究表明，群落结构和优势种群的数量具有时序动态性，微生物多样性与废水的处理效果出现协同变化的特征。测序结果表明，在生物膜中进行氨氧化作用的主要为亚硝化杆菌(Nitrosomonas sp.)、亚硝化螺菌(Nitrosospira sp.)；进行亚硝酸氧化的主要为硝化球菌(Nitrococcus sp.)。

3PCR-DGGE方法的局限性

DGGE技术具有以下缺陷: 1) 其检测的DNA片段最适长度为500bp，超出此范围的片段 DGGE分辨率会下降；2) PCR 扩增所需GC碱基对含量至少达40bp；3)如果电泳的条件不适宜，不能保证将有一定序列差异的DNA片段完全分开，会出现序列不同的DNA迁移在同一位置的现象。DGGE的条带数不能完全精确地反映被分析的混合物中不同序列的数量。有时一条DGGE带可能代表几种物种，从而导致自然群落中生物的数量被低估，或者可能不同的几条DGGE带代表同一物种，从而导致高估自然群落中生物的数量；4)数量较少的物种DNA 可能得不到PCR扩增。

PCR技术本身也存在不足， 1992年Reysenbach发现用rDNA基因在PCR过程中会产生优先扩增现象，只扩增部分细菌的DNA，造成了群落中原始成员的减少。另一个问题就是嵌合体的形成或异源双链的产生。它会影响DGGE图谱中条带的分布。DGGE只能分离较小的片段(1 kb 以下)，较长的片段分离率下降，这就限制了系统发育分析和探针的序列信息量。其次，若选用的条件不是特别适宜，DGGE并不能保证可以将有一定序列差异的 DNA 片段完全分开，可能会出现不同序列DNA的共迁移现象。再者，有些细菌具有多操纵子，使同一种菌的DGGE图谱上出现多条带，从而高估了样品中微生物的多样性。

4结论及展望

以 PCR-DGGE 为代表的现代分子生物学的发展为废水生物处理新工艺中的微生态与微生物特性提供了强有力的方法和手段。通过检测废水生物处理中微生物种群DNA序列多态性、鉴定个体基因，就可以在基因水平上评价种群的遗传分化，并在分子水平上阐述分子适应等生态问题的机制，这对更好地揭示废水生物处理新技术中微生物与环境之间的生态学关系以及为实现新型脱氮工艺系统的优化运行具有深刻的理论研究意义与实际应用价值。

参考文献:

[1]宫曼丽, 任南琪, 邢德峰. DGGE / TGGE 技术及其在微生物分子生 态学 中的 应用[J]. 微生 物学 报, 2004, 44 ( 6 ) :845 848.

[2]Yu Shuili,Liu Yanan,Jing Guolin,et al. Analysis of phosphate-accumulating organisms cultivated under different carbon sources with polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis assay.Journal of Enviromental Sciences,2005,17:611-614.

[3]Zhang Dan,Zhang Demin,Liu Yaoping,et.al.Community analysis of ammonia oxidizer in the oxygen2 limited nitritation stage of OLAND system by DGGE of PCR amplified 16s rDNA fragments and FISH.Joural of Enviromental Sciences,2004,16:838-842.

[4]陈桐生，李建军，齐英华，等.不同PH条件小除臭生物滤池微生物种群结构的分子生态分析.微生物学报,2005,15:446-450.

[5]王晓丹, 翟振华, 赵爽, 等. 北京翠湖表流和潜流湿地对细菌多样性的影响[J].环境科学, 2009, 30( 1) : 280288.

[6]Moura A, T acao M, Henriques I, et al. Characterization of bacterial diversity in two aerated lagoons of a waste water treatment plant using PCR-DGGE analysis[J]. Microbiological Research, 2009, 164( 5) : 560 -569.

[7]孙宝盛, 张斌, 吴卿, 等. 应用PCR-DGGE技术解析 MBR中微生物群落多样性[J]. 天津大学学报, 2008, 41 ( 3 ) : 356-361.

[8]张洪军, 朱彤. A/O工艺膜生物反应器处理生活污水的脱氮特性及硝化菌群的分子检测[J]. 环境污染与防治, 2009,31( 1) : 47-50.

[9]Third KA, Sliekers AO, Kuenen JG, et al .The CANON System (Completely Autotrophic Nitrogen-removal Over Nitrite) under Ammonium Limitation: Interaction and Competition between Three Groups of Bacteria[J].System. Appl. Microbiol, 2001，24(4):588-596.

[10]Egli K, et al. Microbial composition and structure of a rotating biological contactor biofilm treating ammonium-rich wastewater without organic carbon[J].Microb Ecol, 2003，45:419-432.

[11]董远湘，李小明，尹疆，杨麒，钟琼.溶解氧对OLAND 生物膜反应器硝化性能的影响及其微生物种群动态研究[J].环境污染与防治，2005，27(8):561-564.

中图分类号:X830

文献标志码：A

文章编号：1671-1602(2016)08-0022-02

作者简介：武振兴(1983-)，男，汉，秦皇岛抚宁县，工程师，本科，单位：秦皇岛经济技术开发区环境监察大队，研究方向：环境保护。