叶酸调控鸡脾和胸腺IGF2表达的表观遗传机制探究

刘艳利，申　静，支丽慧，李世召，姚军虎，杨小军

(西北农林科技大学动物科技学院，杨凌 712100)



叶酸调控鸡脾和胸腺IGF2表达的表观遗传机制探究

刘艳利，申静，支丽慧，李世召，姚军虎，杨小军*

(西北农林科技大学动物科技学院，杨凌 712100)

摘要：本试验旨在研究胚期注射叶酸对肉鸡脾和胸腺中IGF2基因表达的影响，并进一步探究其调控基因表达的表观遗传学机制。选择重量和大小相近的种蛋360枚，随机分为4组，在孵化期第11天(E11)分别注射0(对照)、50、100和150 μg的叶酸。每个处理选取体重相近的48只1日龄雏鸡，随机分为6个重复，每个重复8只鸡，在饲养的第21和42天取胸腺和脾组织。用RT-PCR方法检测组织中IGF2的相对表达量；重亚硫酸盐修饰克隆测序法(BSP)检测IGF2启动子区域(-648/-479 bp)甲基化水平；DNase I-qPCR方法检测IGF2启动子区域(-847/-616 bp)染色质构象。结果表明，胚期注射100和150 μg叶酸显著提高了受精蛋孵化率(P<0.05)；胚期注射150 μg叶酸显著提高了42日龄脾中IGF2的表达量(P<0.05)、降低了42日龄脾中该基因启动子区的甲基化水平(P<0.05)，并且也显著增加了42日龄脾中IGF2启动子区的染色质可接近度(P<0.05)；然而在21日龄时各叶酸处理组对脾中IGF2的表达均无显著影响(P>0.05)。与脾组织不同，150 μg叶酸处理组显著提高了21日龄胸腺中IGF2的表达(P<0.05)，对42日龄胸腺中该基因的表达却没有显著影响(P>0.05)，并且与对照组相比，150 μg叶酸处理组中21日龄胸腺组织IGF2启动子区的染色质可接近度也显著增加(P<0.05)。由此可见，在种蛋孵化第11天注射叶酸可通过影响基因启动子区的甲基化水平和染色质构象来调控组织中IGF2的表达，并且存在组织器官和时间特异性。

关键词：叶酸；IGF2；甲基化；染色质构象；表观遗传

胰岛素样生长因子2(Insulin-like growth factor 2，IGF2)基因位于鸡第5号染色体，包括3个外显子和2个内含子，其编码的蛋白是一种促有丝分裂多肽，与胰岛素具有相似的结构，对机体正常的生长发育，尤其是在调控胚胎发育上具有重要作用，也是一种胚胎生长因子[1-2]。许多在家禽上的研究均报道IGF2参与机体DNA和蛋白合成，在体内葡萄糖、能量甚至是脂质代谢中具有重要作用[3-4]，并且作为在选育过程中的一个候选基因，其与家禽的一些生产性状例如肌肉及骨骼生长和腹脂率等存在一定的相关性[5-9]。然而关于IGF2在家禽中的表达调控机制却鲜有报道。

近年来，随着表观遗传学的提出，叶酸因具有携带活性甲基集团的功能，作为一碳单位代谢中重要的辅酶因子，有关其影响DNA甲基化的报道也越来越多。有研究报道，在妊娠和哺乳期给母鼠饲喂低叶酸含量的日粮，小鼠长大后其小肠组织中表现出全基因组DNA的低甲基化[10]。然而在断奶后，给小鼠饲喂叶酸含量高的日粮，在结肠和直肠组织中依然发现DNA低甲基化状态[11]。人类大量的流行病学中也涉及到叶酸与DNA甲基化之间的关联，在结肠癌的患者中，叶酸促进了血清全基因组DNA的高甲基化[12]。通过限制绝经女性饮食中的叶酸含量，其白血球中的DNA出现低甲基化现象，并且有一定的剂量依赖效应[13]。体外培养鸡脂肪前体细胞，探究叶酸如何影响家禽脂肪生成基因启动子区DNA甲基化的试验结果表明，未添加叶酸的试验组中，C/EBPα基因启动子区甲基化水平比添加16 mg·L-1的叶酸组降低21.8%，但PPAR基因启动子区的甲基化在各试验组中并没有受到影响[14]。

家禽作为卵生动物，其孵化过程中胚胎发育所需要的营养素和能量不能像哺乳动物那样来源于母体，均依赖于鸡蛋中所积累的物质，因此鉴于家禽胚胎发育的特殊性和IGF2在机体组织生长发育和物质代谢中的重要性，并结合本实验室前期工作[15]，本试验通过在孵化期11胚龄注射不同剂量的叶酸，旨在以研究胚期注射叶酸能否影响肉鸡脾和胸腺中IGF2基因的表达为依据，探讨胚期营养调控基因表达的分子机制，为家禽营养表观遗传学研究建立基础。

1材料与方法

1.1试验设计

选取重量和大小相近的科宝500肉鸡商品代种蛋360枚，随机分为4个处理组并进行孵化。在孵化的第11天(E11)，向4个处理组种蛋的卵黄囊分别注射叶酸0、50、100和150 μg。叶酸溶液提前配制为相应的浓度，0 μg对照组注射的是生理盐水，每个处理组注射体积均为0.1 mL。待出壳后，每个处理选取体重相近的48只小鸡，随机分为6个重复，每个重复8只鸡。饲养期为42 d。

1.2受精蛋孵化率统计

种蛋孵化期间通过照蛋去除未受精蛋，记录每个处理组去除的蛋数，待孵化期过后根据每组的出壳数计算受精蛋孵化率：受精蛋孵化率=出壳数/受精蛋数×100%。

1.3样品采集

饲养的第21和第42天，在每个处理的每个重复中挑选1只与所在重复平均体重相近的鸡只进行屠宰，收集脾和胸腺组织，立即放入液氮，随后转至-80 ℃保存待用。

1.4主要试剂和仪器

叶酸标准品和蛋白酶K购自Sigma公司；组织RNA提取试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司；RNA反转录试剂盒、SYBR试剂盒和pMDTM19-T Vector购自TaKaRa公司；EZ DNA Methylation-GoldTM试剂盒购自美国Zymo公司；组织DNA提取试剂盒和DNA纯化胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；细胞核提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；DNase Ⅰ和PCR纯化试剂盒购自Thermo公司。

核酸定量分析仪(Nanodrop ND-1000)；实时荧光定量PCR仪(iQ5，Bio-Rad 公司)；离心机(Eppendorf)；37 ℃恒温培养箱；恒温摇床。

1.5RT-PCR检测IGF2 mRNA相对表达水平

脾与肝中RNA的提取以及RNA反转录合成cDNA的过程均参照试剂盒说明书进行。实时荧光定量试验使用TaKaRa 公司的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒，选用β-actin作为内参基因。基因的引物序列如下(5′-3′)：β-actin上游ATTGTCCACCGCAAATGCTTC，β-actin下游AAATAA-AGCCATGCCAATCTCGTC；IGF2上游AGACC-AGTGGGACGAAATAACA，IGF2下游CACGC-TCTGACTTGACGGAC。RT-PCR的反应程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算组织中IGF2的相对表达量[16]。

1.6BSP(Bisulfite sequencing PCR)克隆测序法检测IGF2启动子区甲基化水平

组织基因组DNA的提取按照试剂盒说明书进行，每个处理的6个DNA样品两两随机等量混合成为3个样品。随后450 ng的DNA被用来进行亚硫酸盐修饰，具体操作参照EZ DNA Methylation-GoldTM试剂盒说明流程。被修饰的DNA经PCR扩增后电泳跑胶进行目的片段DNA的回收，目的产物纯化后进行pMDTM19-T Vector克隆，每个样品的克隆至少选取20个阳性菌落测序，用来检测IGF2转录起始位点上游-648～-479 bp启动子区域的甲基化水平。具体试验流程参照V.P.Kovacheva等的方法[17]。BSP中PCR引物用Methprimer软件进行设计(http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)，序列如下(5′-3′)：上游TGGTTGTGTTGTAGATTTTT-TTTGT，下游ACACTAAATTTCACCTCCCAT-TTT。检测甲基化的区域包含4个CpG位点，测序后最终每个位点的甲基化水平用在线的QUMA软件分析(http：//quma.cdb.riken.jp/)，每个样品选取13个转化率在95%以上的克隆参与结果统计。

1.7DNaseⅠ-qPCR检测IGF2启动子区染色质疏松度

参照细胞核试剂盒说明书提取组织细胞核，细胞核的DNase I酶切消化参照前人的研究流程[18-20]。消化体系中的DNA用试剂盒进行纯化回收后用于PCR扩增，检测IGF2转录起始位点上游-847 ～-616 bp启动子区域的染色质疏松度，所用引物序列如下(5′-3′)：上游CAGGTGGTGCTGCGATGAC，下游CGGAGATGGAGCCGAAGC。PCR扩增后，经过DNase I酶切消化的样品的Ct值记为Ct (DNase+)，每个样品所设的与之对应的未经过酶消化的Ct值记为Ct (DNase-)，染色质的疏松度用ΔCt=Ct (DNase+)-Ct (DNase-)表示。

1.8数据统计分析

利用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，试验结果除了孵化率采用卡方检验外，其他均采用One-way ANOVA进行单因素方差分析，并用Duncan法进行多重比较，显著性判断标准均设置为P<0.05。

2结果

2.1胚期注射叶酸对受精蛋孵化率的影响

孵化期11胚龄注射叶酸对受精蛋孵化率的影响见表1，与对照组相比，50 μg叶酸注射组并没有显著影响受精蛋孵化率(P>0.05)，但100和150 μg叶酸组显著提高了受精蛋孵化率(P<0.05)。

2.2胚期注射叶酸对鸡脾和胸腺中IGF2表达的影响

孵化期11胚龄注射不同浓度叶酸后，各处理组21和42日龄鸡脾与胸腺中IGF2表达量的分析如图1和图2所示，胚期不同的叶酸注射水平对21日龄脾和42日龄胸腺中IGF2的表达均无显著影响(P>0.05)。但与对照组相比，150 μg叶酸注射组显著提高了42日龄脾和21日龄胸腺组织中IGF2的表达(P<0.05)。

2.3胚期注射叶酸对IGF2启动子区(-648/-479 bp)DNA甲基化的影响

如图3和图4所示，注射不同浓度的叶酸对21日龄脾中IGF2启动子区甲基化水平没有影响(P>0.05)。在42日龄，50和150 μg叶酸注射组脾中IGF2启动区甲基化水平显著降低(P<0.05)；与对照组(28.8%)相比，150 μg叶酸注射组(18.6%)甲基化水平降低了35.4%。胚期注射叶酸对胸腺IGF2启动子区甲基化的影响见图5和图6，与脾组织不同，孵化期第11天100和150 μg叶酸的注射显著增加了21日龄胸腺IGF2启动子区的甲基化(P<0.05)，但所有叶酸处理组对42日龄基因启动子区的甲基化均没有显著影响(P>0.05)。

表1胚期注射叶酸对种蛋孵化率的影响

Table 1Effects of folic acid injected on E11 on the hatchability of fertilized eggs

同列内肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)

Different letters in the same column mean significant difference (P<0.05)

2.4胚期注射叶酸对IGF2启动子区(-847/-616 bp)染色质构象的影响

孵化期注射叶酸对脾中IGF2启动子区染色质可接近度的影响如图7所示，150 μg叶酸注射组显著增加了42日龄脾中该基因启动子区染色质的可接近度(P<0.05)，而50和100 μg叶酸注射组对其并没有显著影响(P>0.05)；与对照组相比，21日龄3个叶酸注射组脾中IGF2启动子区染色质构象均没有显著变化(P>0.05)。由图8可知，仅150 μg叶酸注射组显著增加了21日龄胸腺IGF2启动子区染色质可接近度(P<0.05)，各叶酸处理组对42日龄胸腺该基因启动子区染色质构象均无显著影响(P>0.05)。

2.5IGF2启动子区转录因子预测

采用在线软件(http：//www.genomatix.de)对本试验所涉及的IGF2启动子区域进行转录因子预测，结果如图9所示，图9A预测的区域包含本试验所检测的4个CpG位点，共预测出7个转录因子。图9B预测的是IGF2启动子染色质构象所在的区域，软件预测的结果显示共有39个转录因子。

3讨论

李世召等[21]指出，种蛋注射技术在家禽上已经得到了广泛应用，很多研究学者通过在孵化期注射营养素或疫苗来提高机体的生产性能和免疫功能。有研究表明，在鸡胚孵化期11天注射3 mg维生素C能显著提高种蛋孵化率[22]，与本试验中注射叶酸提高受精蛋孵化率结果一致，说明注射并没有对鸡胚产生危害，并且注射的营养素对孵化率起到积极作用。

本研究结果表明，孵化期150 μg叶酸的注射提高了42日龄脾中和21日龄胸腺中IGF2的mRNA表达，虽然没有关于叶酸在家禽上调控IGF2表达的报道，但有研究表明，IGF2在五指山猪8个组织中的表达量呈时序性变化，并且也存在组织差异[23]。因此叶酸在家禽中上调IGF2的表达可能也存在时间和组织的特异性。

目前，基因表达调节的表观遗传学机制并不完全明晰，有观点认为基因启动子区域的甲基化能通过阻碍转录因子的结合来抑制基因的表达[24]。除此之外，染色质结构的重塑也参与基因的表达调控，启动子区域染色质结构的疏松度与基因的表达成正相关[18]。而叶酸在一碳单位的代谢中扮有重要角色，与甲基集团的转移有关，参与DNA和组蛋白的甲基化过程。本试验中，150 μg叶酸组显著降低了42日龄脾中IGF2启动子区域的甲基化，并提高了启动子区域的染色质疏松度，与该日龄组织中IGF2表达的上调相对应。胆碱与叶酸在一碳单位代谢中具有类似的功能，有研究表明，通过给孕期母鼠饲喂高胆碱日粮，能够降低小鼠肝中IGF2基因调控区域的甲基化[17]，与本试验中叶酸降低脾IGF2启动子区甲基化的结果相似，并且有研究认为，CpG的甲基化能够通过转录抑制复合子来诱导组蛋白的去乙酰化，进而影响染色质的重塑来沉默基因的表达[25]。通过对IGF2启动子区域进行转录因子预测发现，在本试验中所涉及到的DNA甲基化和染色质构象测定区域均存在转录因子结合位点，表明叶酸有可能通过改变DNA甲基化来影响转录因子的结合进而调控IGF2的表达。

与脾组织不同的是，叶酸对胸腺IGF2的表达、基因启动子甲基化以及构象的影响均体现在21日龄上，虽然150 μg叶酸组对21日龄胸腺IGF2的表达和IGF2启动子染色质构象的影响与对42日龄脾组织的影响结果相同，但对IGF2启动子区甲基化的影响结果却完全相反。体外培养鸡的脂肪前体细胞研究表明，添加16 mg·L-1叶酸的试验组C/EBPα基因启动子区甲基化水平与对照组相比升高了21.8%[14]，与本试验中叶酸提高21日龄胸腺IGF2启动子区甲基化的结果一致，这就表明在21日龄胸腺中，IGF2的表达虽然受启动子区甲基化和染色质构象的影响，但染色质构象更占主导地位。

5-甲基四氢叶酸因其结构的特殊性，可携带活性甲基集团，作为S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成的甲基提供者，通过对DNA甲基化作用，改变表观遗传，故叶酸参与调控DNA甲基化已得到普遍共识[26]。但在不同动物、不同细胞以及不同目的基因中，叶酸对DNA甲基化的影响结果却不尽相同[27-28]。机体中，SAM合成所需要的甲基也可来源于其他营养素例如胆碱和甜菜碱，并且SAM接收来自叶酸最终携带的甲基基团的过程中也受很多辅酶因素(维生素B2、B6和B12等)的制约[29]，也有研究称叶酸的添加可能会打破细胞内一碳单位的代谢[30]。因此，叶酸对组织IGF2启动子区甲基化的影响出现不同的结果可能与日龄以及组织的不同有关。

除此之外，虽然基因的表达与其启动子区的甲基化和染色质构象有关，但甲基化与染色质构象之间的内在关系至今仍没有明确定论，有学者认为，甲基化的DNA能够招募甲基胞嘧啶结合蛋白2(MeCP2)，此蛋白有一个转录抑制结构域(TRD)，它能结合另一个抑制子蛋白mSin3A，mSin3A蛋白是包括组蛋白去乙酰化酶在内的多重蛋白复合体的结构中心，能使组蛋白去乙酰化，从而改变染色质构象[25]。本试验中，叶酸虽然提高了21日龄胸腺IGF2启动子区的甲基化水平，但染色质疏松度反而升高，故在不同的组织中，叶酸通过甲基化和染色质构象调控IGF2表达可能存在不同的机制，本试验结果预测到IGF2启动子区有转录因子结合位点的存在，但在家禽上有关表观遗传调控基因表达的研究较少，是否叶酸是通过转录因子为中介并连结DNA甲基化和染色质构象来调控基因转录有待将来进一步的深入研究。

4结论

在鸡胚孵化第11天注射叶酸能够通过改变IGF2启动子区甲基化和染色质构象来调控脾和胸腺中IGF2的表达，但存在组织和时间特异性，启动子区甲基化与染色质构象改变的内在联系有待进一步研究。

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(编辑郭云雁)

The Study on Epigenetic Mechanism ofIGF2 Expression in Spleen and Thymus Regulated by Folic Acid in Broilers

LIU Yan-li，SHEN Jing，ZHI Li-hui，LI Shi-zhao，YAO Jun-hu，YANG Xiao-jun*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

Key words:folic acid；IGF2；methylation；chromatin structure；epigenetics

Abstract:The study was conducted to investigate the effects of folic acid injected in incubation period onIGF2 expression in spleen and thymus in broilers，further exploring epigenetic mechanism of folic acid modulating gene expression.A total of 360 eggs，whose weight and size were mostly same，were selected and randomly assigned to 4 treatments.0，50，100 and 150 μg folic acid were injected into eggs，respectively on E11 of incubation.After hatching，48 healthy 1-day-old chickens selected from each treatment were divided into 6 replicates and 8 birds each.Spleens and thymus were collected at the age of 21 and 42 d.The mRNA expression ofIGF2 were tested by RT-PCR；BSP was used to determine the methylation level ofIGF2 gene promoter region from -648 to -479 bp and DNase I-qPCR for chromatin structure of theIGF2 promoter from -847 to -616 bp.The results were shown as followed：100 and 150 μg folic acid groups improved hatchability of fertilized eggs(P<0.05)；150 μg folic acid injected on E11 significantly up-regulatedIGF2 expression in spleen (P<0.05) and reduced methylation level of gene promoter at the age of 42 d (P<0.05)；Chromatin accessibility ofIGF2 promoter region was improved in 150 μg folic acid group at the age of 42 d(P<0.05)in spleen.Different from spleen，150 μg folic acid didn’t affectIGF2 expression in thymus at the age of 42 d(P>0.05)but significantly increased gene expression in thymus at the age of 21 d(P<0.05).Compared with the control group，150 μg folic acid improved chromatin accessibility ofIGF2 promoter in thymus at the age of 21 d(P<0.05).Overall，the results indicated that folic acid injected on E11 could affectIGF2 expression in tissues by altering methylation level and chromatin structure of gene promoter，and there exists specificity on organs and time.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.012

收稿日期：2015-04-13

基金项目：国家自然科学基金项目(31272464)；教育部新世纪优秀人才项目(NCET-12-0476)；陕西省农业攻关计划(2014k01-18-02；2015NY149)；陕西省科技统筹创新工程计划项目(2015KTCQ02-19)

作者简介：刘艳利(1993- )，女，河南伊川人，硕士生，主要从事畜禽免疫营养调控与营养表观遗传调控相关研究，E-mail：1085752204@qq.com *通信作者：杨小军，教授，E-mail：yangxj@nwsuaf.edu.cn

中图分类号：S831.4

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)02-0296-09