鸡新城疫血凝和血凝抑制试验操作注意事项

王丽娟

（辽宁职业学院，辽宁　铁岭112099）

鸡新城疫血凝和血凝抑制试验操作注意事项

王丽娟

（辽宁职业学院，辽宁铁岭112099）

鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验结果常常因为操作不规范、使用标准不准确等人为主观因素的影响，导致试验结果不准确，甚至失败。本文着重对鸡新城疫HA与HI试验血样的采集和处理、器材的选择、试剂配制、HA试验、HI试验等操作中的注意事项作以简要阐述，以供参考。

新城疫；HA试验；HI试验；注意事项；鸡

鸡新城疫是严重威胁养禽业发展的主要疫病之一，给养禽生产造成巨大经济损失。HA和HI试验是诊断鸡新城疫、检测鸡群免疫抗体水平、免疫效果和确定免疫时机最常用的实验室检验方法。该试验方法具有操作简便、快速、准确、实用经济和对抗体水平进行量化的优点，能够处理大量的样品，在基层临床实践中被广泛应用。但试验结果常常因为操作不规范、使用标准不准确、试验材料不标准等人为主观因素影响很大，导致试验结果不准确，甚至失败。因此做试验前必须掌握操作要领和注意事项，精心操作，提高试验的准确性。

1　血样的采集和处理

1.1样品采集采血者要做好自身防护工作，做到无菌采样。采血部位一般以翅静脉为主，雏鸡多用心脏采血。采血量为0.5～1mL。取血要缓慢平稳，避免静脉塌陷或出现血泡。取样后将采血器的活塞向后拉一小段，针筒内留出部分空间，并将采血器稍倾斜放置，以便血液和空气充分接触。为减少脂血，可在动物进食前采集血样。

1.2样品处理血样在运输过程中不可剧烈振荡和摇晃，以免溶血。室温在25℃以上时全血容易凝固，静置2～4h即可析出血清。若气温过低可放入37℃温箱中孵育2～3h或血液完全凝固后3000r/min离心2～5min，即可获得血清样品，将析出的血清移至小塑料离心管中及时冷藏备用。有溶血、胶胨样现象的血清样品应弃去。

1.3样品贮存血清样品要及时检测，4℃冰箱中冷藏可保存5d，长时间保存可置-20℃环境下冷冻，检测前应缓慢溶化并充分混匀，避免反复冻融。

2　器材的选择

2.1血凝反应板选择一次性使用96孔90°的V型血凝反应板，应选择质量好、孔面规整及V型内孔面洁净光滑的反应板，板面有弯曲甚至折痕的反应板要及时剔除，若不加选择，则会影响红细胞凝集和结果判定。整包开封后，若一次使用不完，应保持包装尽量完整，确保剩余反应板的清洁无磨损。

2.2移液器主要有单道、多道可调微量移液器，应选择合适的量程，以便精确度的提高。吸头在装配时，切勿用移液器反复上下撞击吸头来上紧。吸液时用大拇指先按到第一档，再将吸头尖端垂直浸入液面3mm以下，缓慢释放按钮，待液体进入吸嘴。放液时将移液器稍倾斜，吸头对准板孔，先按到第一档，打出大部分液体，再按到第二档，将剩余的液体全部排出。应做到“慢吸快打”，保证加入液体的体积一致。加样完毕，把移液器的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态，定期进行校正或鉴定，避免产生错误或不精确的结果。

2.3吸头应选择与移液器相匹配的一次性吸头，要求吸头内清洁无菌，吸头表面光洁平滑，防止液体滞留外壁或吸头内堵塞引起误差。

3　试剂配制

3.1稀释液依据《新城疫诊断技术》（GB/T16550-2008）国家标准，HA和HI试验的稀释液为0.01mol/LpH7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）。最好现配现用，高压灭菌后使用。稀释液的pH值控制在7.0～7.2。pH值在5.8以下红细胞易发生溶血或自凝；pH值在7.8以上，吸附于红细胞上的病毒易脱落，凝集图像容易消失，对照有可能不成立。

在实际生产中，也可采用灭菌的生理盐水做稀释液，pH值应保持在7.0，如有偏差，可用磷酸二氢钾调节。用生理盐水比PBS稀释液测出的抗体效价要低1个值。

3.21%鸡红细胞（RBC）悬液为避免鸡只个体的红细胞差异，应采集至少3只SPF公鸡或健康无新城疫和禽流感抗体的非免疫成年公鸡的血液。采血之前在一次性注射器中先吸入抗凝剂，再采血。采血完毕，迅速颠倒混匀，防止血凝和溶血，要拔下针头，贴管壁缓慢注入已事先加入3～4倍体积的PBS的离心管中，混匀，以2000r/min离心5～10min，先吸弃红细胞上层的白细胞薄膜和血浆，再吸弃上清液；向沉淀的红细胞再加PBS，缓慢混匀，重复以上步骤，反复离心洗涤3～5次，直至洗净血浆和白细胞为止。一定吸取底部压积红细胞放入已事先加入PBS的容器中，混匀配成体积分数为1%鸡红细胞悬液，短期于4℃冰箱保存备用，最好现配现用。

3.3工作试剂主要有病毒标准抗原、阳性血清和阴性血清。冻干的试剂应按照说明中规定的体积用0.01mol/LpH 7.2PBS稀释液溶解，最好用灭菌注射用水或纯水。为避免反复冻融和细菌污染，应根据每次使用的量，以无菌操作将溶解试剂分装成小包装后置于-20℃冷冻保存，分批使用。

4　HA和HI试验

4.1工作抗原每次试验前必须检测抗原的血凝效价，以确定4个血凝单位（HAU）工作抗原的配制。为避免误差，最好同时进行3排病毒抗原的测定，判定结果时取平均值作为血凝终点滴度。4HAU抗原在HI试验前需做回归试验验证，现配现用，室温下不可久存，且不可反复冻融。如检验样品过多，最好放在冰上，以免抗原失效。

4.2加样加稀释液时，应加在板孔的底部。抗原、血清样品在加入之前要混匀，保证加样的均一性。4HAU抗原和1%红细胞悬液在使用时要边加边摇匀，保证每孔所加的样品量和浓度准确一致，并且应在板内液面上方加样，要避免移液器吸头与孔内的液体接触，应从后往前加，先对照、再高稀释倍数、最后低稀释倍数顺序悬滴加入，减少交叉污染，从而增加了结果的准确性。

4.3倍比稀释抗原或血清移液器稍倾斜一定角度，使用第一档稀释液体，应每孔至少反复吹吸5～7次，且每孔吹吸次数要一致，滴头不要离开液面，防止产生气泡，以便混合均匀。

4.4温度控制4℃以下红细胞易发生自凝；在37℃时，凝集的红细胞易从病毒中解脱，使凝集现象消失。故试验环境温度应控制在20℃～25℃室温。

4.5时间控制新城疫病毒表面不仅具有血凝素（HA），还具有神经氨酸酶（NA），可破坏病毒的血凝性，使病毒从吸附的红细胞解脱，时间过长，红细胞从病毒表面脱落造成错判，所以静置孵育时间应严格控制。应不时观察，在PBS对照孔的红细胞呈明显钮扣状沉到孔底时判定结果较好，大约在20～40min左右，时间过早或过晚都会影响试验结果的判定。

4.6对照试验每次试验必须设定适当的阳性血清、阴性血清（稀释方法同被检血清）和抗原对照，尽量每个反应板都要设置阴阳性对照，以验证试验是否成立。只有阴性血清的HI效价不大于2log2，阳性血清的HI效价不超过标准值的±1个滴度，HI试验结果判定才有效。

4.7HA和HI试验的结果判定在PBS对照孔结果正确的情况下，将血凝板倾斜，从背侧观察，对照孔的红细胞应沿倾斜面完全呈泪珠状流淌。以红细胞完全不流淌的一孔作为该抗原的血凝效价，为1HAU；参照对照孔，与PBS对照孔中的红细胞泪滴大小、流速一致的血清最高稀释倍数作为该血清的血凝抑制（HI）效价。若4HAU抗原对照孔没有完全凝集，生理盐水对照孔没有完全沉淀，此反应板试验失败，样品要重新检测。

4.8稀释度的选择HA效价高于11log2和HI效价高于10log2时可继续增加稀释度。

综上所述，鸡新城疫HA和HI试验结果准确与否，与试验各个影响因素的综合作用密切相关。因此，要严格按照操作规程认真细致的进行操作，并在一些操作技巧和熟练程度上苦下功，尽量消除不利因素，减少误差，保证试验结果的准确性。

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10.3969/J.ISSN.1671-6027.2016.06.016

王丽娟（1967～），学士，副教授，从事兽医微生物学和免疫学技术研究