猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白在疫苗上的应用研究进展

姚睿智，樊宏超，邓清华，姚春雨，马德慧*

（内蒙古民族大学 动物科技学院，内蒙古 通辽 028000）

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白在疫苗上的应用研究进展

姚睿智，樊宏超，邓清华，姚春雨，马德慧*

（内蒙古民族大学 动物科技学院，内蒙古 通辽 028000）

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是影响养猪业发展的主要病原。GP5蛋白是PRRSV的主要糖蛋白，是中和抗体的主要靶标。因此，GP5蛋白的研究在PRRSV感染的诊断和新型基因工程疫苗的研发上具有重要意义。近年来，对于GP5蛋白的研究取得了重要的进展，本文就GP5蛋白的特性、功能和应用等方面进行综述。

猪繁殖与综合征病毒；GP5蛋白；基因工程疫苗

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）所引起的一种严重影响养猪业发展的急性、接触性、高致死性传染病。其主要临床表现为妊娠母猪繁殖障碍和新生仔猪重症肺炎，并常伴有免疫抑制、持续感染及继发感染。1996年郭宝清等首次从国内暴发PRRS猪群流产胎儿中分离到PRRSV，从而证实了我国猪群存在PRSSV感染。目前，PRRSV普遍流行，给养猪业造成了巨大的经济损失。

PRRSV是一种具有囊膜结构、不分节段、单链RNA病毒，属动脉炎病毒科动脉炎病毒属。PRRSV根据基因组序列不同可分为美洲型和欧洲型，两者之间约有40%氨基酸序列差异。近几年，在我国主要流行的高致病性PRRS的分离毒株与美洲型在抗原结构上具有同源性。PRRSV基因组大小约为15kb，包含10个开放性阅读框，可编码多种结构蛋白和非结构蛋白5。其中ORF5编码的GP5蛋白是一种N端糖基化的囊膜蛋白，是PRRSV三种主要的结构蛋白之一。GP5蛋白是主要的保护性抗原蛋白，其表面具有多个抗原决定簇，且含有PRRSV主要的中和位点，具有较好的免疫原性，能诱导机体产生特异性中和抗体，并具有最强中和PRRSV的能力，产生较多的免疫保护率。此外，GP5蛋白在病毒装配和免疫反应中也扮演着重要角色，同时还具有诱导某些细胞发生程序性死亡等功能。因此，对GP5蛋白的研究在PRRSV感染的诊断和新型基因工程疫苗的研发上具有重要意义。

1 GP5蛋白的概述

GP5蛋白是由ORF5所编码的一种位于PRRSV包膜上的跨膜糖蛋白，分子质量约为24.5～26KD。根据PRRSV的基因型及其编码的氨基酸序列进行分析，结果表明，美洲型和欧洲型GP5蛋白的氨基酸数目分别为200和201个，且变异性较高，欧洲型毒株自身GP5蛋白的同源性为87.1%～99.25%，而美洲型毒株则为89%～94%，这种高突变率使得两种基因型的PRRSV之间缺少免疫交叉反应。GP5蛋白的N末端含有一个信号肽序列，共由31个氨基酸残基组成，其功能是引导蛋白质的形成。

GP5蛋白含有6个抗原决定簇，其中有一个血清型特异的线性中和决定簇，可以诱导机体产生中和性抗体，并可以在体外中和PRRSV的感染。研究发现，GP5蛋白含有2个B细胞抗原位点，分别为非中和性A抗原表位和中和性B抗原表位。A抗原表位位于B抗原表位上游，当A抗原表位与B抗原表位同时出现时，A抗原表位可能作为诱骗因子（诱骗表位），在PRRSV感染后迅速诱导机体产生非中和性抗体，使抗中和性B抗原表位的抗体产生至少延缓3周，从而抑制了中和性抗原表位B被免疫系统识别。中和性抗体产生的推迟是PRRSV逃逸免疫监视的主要机制，也是PRRSV感染的主要特征。

PRRSV美洲型和欧洲型均能在机体内、外引起细胞凋亡。而PRRSV所引发的细胞凋亡作用与GP5蛋白密切相关。研究发现，GP5蛋白所诱导的细胞凋亡并不能被抗凋亡蛋白Bcl-2所抑制。这说明GP5蛋白所诱导的细胞调亡可能作用于抗凋亡因子Bcl-2的下游，因而增加了促凋亡蛋白的表达量，打破了细胞内促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之间的平衡，使细胞色素C从线粒体中释放到细胞质中，引发细胞凋亡。同时，有研究显示GP5蛋白N端的前119个氨基酸在诱导细胞凋亡中发挥重要作用，而C端缺失并不影响其诱导细胞凋亡的活性。

2 基于GP5蛋白的新型疫苗

目前，PRRS疫苗主要是灭活和弱毒疫苗。但是，就其在临床上的使用效果来看，两者的安全性或有效性存在着一些缺陷。故而，开发更加安全、高效、廉价的新型基因工程疫苗已成为当前亟待解决的问题。由于GP5蛋白具有良好的免疫学特性，使其成为了研制新型基因工程疫苗的首选蛋白。因此，以GP5蛋白为基础的DNA疫苗、重组亚单位疫苗及活病毒载体疫苗成为了主要的PRRS新型疫苗。

2.1 DNA疫苗 DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗。Kwang等应用真核表达载体分别构建了 PRRSV ORF4、ORF5、ORF6、ORF7 4种重组DNA疫苗，并进行了动物试验，根据试验结果推测PRRSV的抗原中和表位主要集中于GP4和GP5蛋白上。Barfoed等将PRRSV的ORF1～7均制成了DNA疫苗，免疫猪后发现，以ORF5构建的DNA疫苗进行免疫的猪体内抗体滴度最高，证明GP5蛋白是制备DNA疫苗的首选蛋白。马德慧等将GP5和M蛋白基因克隆在PEGFP-C1载体上，成功构建了基因疫苗表达载体pEGP5-C1和pEM-C1，并对小鼠进行了免疫试验，诱导小鼠产生了特异性抗体，并在二次免疫后的第一周开始检测到特异性淋巴细胞增殖反应，证明该重组质粒具有良好的免疫原性，为接下来进行猪体免疫试验和DNA疫苗的研究提供了实验数据和理论基础。

“自杀性”DNA疫苗（Suicidal DNA vaccine）是近年来以甲病毒复制子为基础发展起来的一种新型DNA疫苗，具有安全、高效、易制备、易保存等优点，一些“自杀性”DNA疫苗的免疫剂量较现阶段常规疫苗少100倍左右，是基因疫苗发展的一项重大突破。方六荣等成功构建了一株含有ORF5基因的“自杀性”DNA疫苗，并对猪进行了2次免疫试验，间隔期为4周，结果证明“自杀性”DNA疫苗在诱导中和抗体和细胞免疫等方面都优于常规DNA疫苗。江云波等成功构建了共表达GP5和M蛋白的“自杀性”DNA疫苗pSFV-56，通过体外瞬时转染和Western blot检测，证实表达的GP5和M蛋白可以形成GP5/M异源二聚体，从而产生协同作用，能够更好的诱发小鼠和断奶仔猪产生较高的特异性中和抗体和细胞免疫应答，为获得能够较好地防制PRRSV的新型疫苗提供了新的思路和途径。

虽然，DNA疫苗的研究已经取得很大的进展，但因其受母源抗体及外源基因不断刺激机体产生抗体造成免疫抑制等因素的影响，其免疫效果并不稳定，因此DNA疫苗在实际应用上受到了一定的限制，还需要进一步的研究和完善。

2.2 重组亚单位疫苗 重组亚单位疫苗又称生物合成亚单位疫苗。Plana等将PRRSV ORF2～ORF7基因分别插入到杆状病毒表达载体内，用表达的ORF3和ORF5基因产物对怀孕母猪进行免疫保护试验，结果发现GP3和GP5蛋白免疫母猪后可提供部分保护，说明GP3和GP5亚单位疫苗具有良好的免疫原性，可以作为研制重组亚单位疫苗的候选基因。病毒样颗粒（birus-like particles，VLPs）疫苗因具有较强的免疫原性和生物学活性，且不具有感染性和细胞毒性，而成为近年来的研究热点之一。乙型肝炎病毒核心蛋白（hepatitis B virus core protein，HBc）是一类用于病毒颗粒疫苗的载体，它能够在原核、真核和植物表达系统中高效组装成病毒样颗粒，且外源序列的插入位点并不单一，本身也可以作为佐剂，因此使其具有广阔的发展空间。曹佳媛等将GP5蛋白基因插入乙型肝炎病毒核心蛋白（hepatitis B virus core protein，HBc）载体中，成功构建含有GP5蛋白的HBc-GP5病毒样颗粒疫苗，为研发新型PRRS亚单位疫苗提供了新思路。

2.3 活载体疫苗 PRRS的活载体疫苗主要是以腺病毒、鸡痘病毒和伪狂犬病毒等为载体来表达PRRSV的主要免疫原性基因。Alonso等首次以传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis coronavirus，TGEV）辅助表达系统为载体，成功构建了表达GP5蛋白的重组TGEV，并采用滴鼻、口服和胃肠道三种途径对仔猪进行三次联合免疫，结果可检测到很高的 GP5特异性抗体。许信刚等将去除信号肽的 PRRSV ORF5基因插入到PYA3341表达载体上，成功构建了重组质粒pYA3341-ORF5，将重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550，获得口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株X4550（pYA3341-ORF5），并对猪进行了免疫试验，证明重组疫苗菌株X4550（pYA3341-ORF5）能有效刺激诱导机体产生抗GP5蛋白抗体，且具有良好的免疫效果，为PRRSV口服基因工程疫苗的研究奠定了基础。

3 小结

GP5蛋白是PRRSV的主要保护性抗原蛋白，具有较好的免疫原性，能诱导机体产生特异性中和抗体，还具有锚定细胞膜吸附宿主细胞的功能。此外，GP5蛋白能够参与病毒装配和免疫反应，也可以诱导某些细胞发生程序性死亡。虽然，关于GP5蛋白的一些免疫学机理尚未明确，但在新型PRRSV疫苗的研究中，GP5仍是首选蛋白。

随着分子生物学技术的发展，国内外针对PRRSV疫苗的研究都有很大的进展，但PRRSV的预防与控制仍旧是危害当今养猪业的一大难题，因此，开发安全、高效、廉价的PRRSV新型疫苗并将其推广至临床应用仍是今后努力的方向。

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10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．03.001

国家自然科学基金项目（31460662）

★通讯作者