副黏病毒反向遗传研究进展

冉旭华,刘阳阳,闻晓波

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江 大庆 163319)

副黏病毒反向遗传研究进展

冉旭华,刘阳阳,闻晓波⋆

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江 大庆 163319)

反向遗传学是对已知的生物基因序列进行适当的修饰和改造后并获取相应的表型,进而研究基因的变化对表型的影响等。副黏病毒属于单股负链RNA病毒,其反向遗传研究对其病毒蛋白的功能、致病机理及重组病毒的开发利用具有重要的研究价值,本文综述了副黏病毒反向遗传近年来的研究进展,为副黏病毒及单股负链RNA病毒的深入研究提供参考。

反向遗传;副黏病毒;致病机制;病毒拯救

经典遗传学的研究规律是首先认识生物的表征特点,然后以此为基础对遗传物质的差异性及进化规律进行研究。而反向遗传学则是对已知生物基因序列进行适当的修饰和改造并获得相应的表型,随之发展而来的技术称为反向遗传技术。RNA病毒的反向遗传的出现使得人们能够在c DNA层面对RNA病毒进行操作,为RNA病毒的生物学特性研究、致病机理研究以及重组疫苗载体研究开辟了新的道路。第一个成功拯救的RNA病毒是Qβ噬菌体［1],研究人员将含有噬菌体全基因c DNA克隆的质粒转化至大肠杆菌,并成功拯救具有活性的Qβ噬菌体,该系统的构建使得在DNA层面对RNA病毒进行研究成为可能。将含有单股RNA(single st rand RNA,ss RNA)病毒基因组的感染性克隆cRNA转染真核细胞可直接获得重组病毒,而单股副链RNA(single negative strand RNA,-ssRNA)病毒则不适用于这一方法,其拯救系统较为复杂。

副黏病毒家族成员均为-ssRNA病毒,包含了一大群影响公共健康与经济发展并可引起人及动物严重疾病的病原体［2],因此开展疫苗研发及致病机制的研究为相关疾病的防制具有重要意义。由于副黏病毒基因组结构简单,序列明确且具有较为深厚的反向遗传学研究基础,因此利用反向遗传技术探索副黏病毒生物学特性以及疫苗开发是目前的研究热点。本文以副黏病毒为-ssRNA病毒的代表,通过对副黏病毒的反向遗传进展进行综述,期望可以为副黏病毒以及-ssRNA病毒相关研究提供些许帮助。

1 副黏病毒反向遗传策略研究

1994 年,科研人员成功拯救狂犬病毒(rabies virus,RV)［3],该研究证明了从cDNA水平直接拯救-ssRNA病毒的可行性。自此之后,人们对于-ss-RNA病毒的反向遗传研究进入了一个新的阶段,多个种属的-ssRNA病毒反向遗传系统相继被建立。副黏病毒家族最早实现病毒拯救的是仙台病毒(Sendai virus,SeV)［4]、麻疹病毒(M V)［5]以及人呼吸道合胞体病毒(H RSV)［6]。在此之后大部分副黏病毒通过反向遗传技术获得拯救并得到初步应用。对副黏病毒的研究表明,当病毒核苷酸总数为6的倍数时病毒可进行有效复制,这一发现被称为副黏病毒的“六碱基原则”。进一步的研究发现,核蛋白特异性的与6个核苷酸发生结合以及“六碱基原则”的出现可能是由于核苷酸与N-phase context之间正确的识别定位所导致的［7]。副黏病毒家族大多数成员严格遵循这一原则,但也有特例,如呼吸道合胞体病毒(RSV)［8]。这一原则的发现提示研究人员在进行副黏病毒反向遗传操作时,不论是进行内源基因的缺失、改造还是外源片段的插入都应当准确考虑到重组病毒基因组的核苷酸数目,因为这可能会影响到病毒的拯救效率。目前反向遗传的病毒拯救主要分为两种方法,即细胞外转录与细胞内转录。

1.1 细胞外转录体外转录是较早开发出来的在DNA水平上对RNA表达进行调控的分子生物学方法,对于大部分非逆转录RNA病毒来说其复制过程并不涉及DNA中间体,这就大大限制了在基因水平上对RNA病毒的研究,而细胞外转录技术的出现为研究RNA病毒基因调控及分子遗传方面提供了新的思路。细胞外转录,即在无细胞系统中以DNA作为模板, NTP为原料,在RNA逆转录酶的催化下模仿体内转录机制生成RNA的过程。转录所用DNA模板应满足以下条件:首先DNA模板长度应不小于拯救病毒的RNA基因组,其次全长序列要在T7或其他启动子的控制之下,另外为了提高转录效率通常在启动子后面人为地加上2到3个鸟嘌吟(G)残基。正常的RNA病毒其基因组的5′端常带有病毒基因组共价结合连结蛋白(Virus genome-linked protein,VPg),该蛋白由NIa-Pro蛋白酶从NIa的氨基端水解而得到且对于病毒基因组的复制具有重要影响。因此,为了模拟该结构,转录获得的RNA序列还要在5′端加上帽子结构CAP(m7GpppG),所谓CAP结构是指真核生物蛋白表达过程中转录出的mRNA 5′端的一个特殊结构,该结构的加入除了可以提高转录效率之外还可以增加转录RNA的稳定性,保护其不被细胞中的核酸酶降解。与5′端相对应,即在转录RNA 3′端同样需要一个稳定的序列来保证稳定转录,这个序列被称为poly(A),对脊髓灰质炎病毒(poliovirus)的研究表明:RNA病毒复制与其3′端poly(A)尾序列有关［9],推测该结构与RNA病毒的体外转录亦具有重要关系。1984年,Ahlquist及其同事［10]利用体外转录方法成功拯救具有感染性的雀麦花叶病毒(Brome Mosaic Virus,BMV)。该研究成功搭建了以DNA为模板研究RNA病毒的桥梁,为RNA病毒研究开辟了新的方向。

1.2 细胞内转录RNA病毒的细胞外转录技术虽应用较广但也有它自己的不足之处,如较低的转染效率以及转录的不稳定性使得拯救的病毒由于缺乏完整性而无法继续复制,另外因细胞外转录技术需要价格高昂的转录试剂。因此,为了克服上述缺点,细胞内转录技术应运而生,而副黏病毒的反向遗传系统多是以该技术开发的。最初科研人员尝试直接将连有RNA病毒cDNA克隆的重组载体直接转染真核细胞但未获得重组病毒,究其原因是缺乏必要的体内转录条件及适合的转录起始信号。

1.2.1 T7 RNA聚合酶拯救系统随着分子生物学技术的快速发展,相继建立起来越来越多的细胞内转录系统。目前副黏病毒应用较多的是基于T7 RNA聚合酶体内转录拯救系统［11]。具体方法是将体外构建的在T7启动子控制下全长cDNA克隆及辅助蛋白表达质粒共转染能够稳定表达T7 RNA聚合酶的真核细胞。一旦重组质粒进入细胞,T7 RNA聚合酶便会特异地识别T7启动子下游的外源片段并转录出全长RNA或mRNA,然后进入病毒自身的复制周期产生重组病毒。构建稳定表达T7 RNA聚合酶细胞的方法通常是在转染前对细胞预先感染能够表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒(vT F7-3)或建立能够稳定表达T7 RNA聚合酶的细胞系。副黏病毒早期拯救策略选用的痘苗病毒是基于牛痘病毒W R株构建的稳定表达噬菌体T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3,然而由于vTF7-3可以在哺乳动物细胞上进行有效复制但产生明显的病变,因此可能影响病毒的拯救效率。为了解决这一问题,研究人员尝试利用具有宿主复制范围的MVA痘苗株并以其为载体表达T7 RNA聚合酶,而研究人员利用MVA-T7成功拯救出了牛瘟病毒(rinder pest virus,RPV)与人副流感病毒3型(human parainfluenza virus type 3,HPIV3)［12]。

运用辅助病毒进行拯救的方法尽管经过优化但仍存在某些缺陷,如在不同细胞系中辅助病毒的感染量存在差异且不易清除。稳定表达T7 RNA聚合酶细胞系的建立为上述问题的解决找到了新的出路。1995年,Radecke及其同事［5]构建了能够稳定表达麻疹病毒核蛋白、磷蛋白以及T7 RNA聚合酶的人胚胎肾293细胞系(human embryonic kidney 293 cellline)并利用该细胞系成功拯救麻疹病毒,随后Takeda等［13]发现利用重组痘病毒及稳定表达T7 RNA聚合酶的细胞系均可成功拯救高致病性麻疹病毒株IC-B,且拯救效率无明显差异。1999年,研究人员利用新霉素筛选成功构建稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK-21细胞,即BSR T7/5细胞系,随后研究人员利用该细胞系成功拯救牛呼吸道合胞体病毒(BRSV),并发现非结构蛋白NS2并不是病毒复制的必需因素［14]。这些发现为副黏病毒的反向遗传研究奠定了基础。

1.2.2 RNA聚合酶II拯救系统除T7 RNA聚合酶之外,利用哺乳动物细胞固有的RNA聚合酶I或II对副黏病毒进行拯救亦是另一种可行且有效的方法,由于不涉及到预感染辅助病毒及构建稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系,故该方法是目前为止较为简便的病毒拯救策略。最先应用RNA聚合酶进行病毒拯救的是分节段A型流感病毒［15],RNA聚合酶Ⅱ转录产生的RNAs具有稳定的5′cap及3′poly(A)尾结构,在与通常用于核内转录的RNA聚合酶I联合利用时可极大地提高重组病毒的拯救效率。可以被RNA聚合酶Ⅱ识别的启动子包括巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子、β肌动蛋白(β-actin)启动子以及猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40, SV40)启动子等。2002年,Le Mercier及其同事［16]在研究缺陷型狂犬病毒(Rabies virus,RV)时发现,在病毒全长基因组cDNA克隆的两端加入锤头状核酶序列(hammerhead ribozyme,HamRz)以及丁肝病毒核酶序列(hepatitis delta virus ribozyme, HdvRz)可显著影响重组病毒的拯救效率,主要原因在于HamRz自我切割及HdvRz的反式切割作用可获得正确长度的病毒RNA基因组,这将有利于后期的核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)装配及重组病毒粒子的稳定增殖。Inoue等［17]利用RNA聚合酶II识别的CMV启动子在多个哺乳动物细胞系上成功拯救具有感染性的狂犬病毒,随后利用该系统成功拯救副黏病毒科的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)［18]以及小反刍兽疫病毒(Pestedes petits ruminants virus,PPRV)［19]。

2 副黏病毒反向遗传的应用

2.1 基因功能研究对目的基因进行适当修饰或者干扰相应蛋白的表达以研究其在病毒复制周期中的作用是目前研究病毒及宿主功能蛋白较为可行的方法。研究人员利用反向遗传学技术成功拯救缺失部分非结构N S2的重组B R S V,进一步研究发现缺乏完整N S2蛋白的重组病毒复制效率显著低于野生亲本毒株,进而推测N S2蛋白虽不直接构成病毒粒子但在病毒复制的过程中也起到了重要作用［14]。2000年,S chmidt及其同事［20]构建了F及H N蛋白被B PIV3替换的重组HPIV3,将该重组病毒人工感染恒河猴并发现相比于对照重组病毒在恒河猴上呼吸道以及下呼吸道的增殖及致病能力显著下降,以上结果表明PIV3表面糖蛋白与病毒在宿主体内的复制密切相关。

2.2 致病机理研究病毒结构与功能有着密不可分的关系,特别是一些与病毒毒力相关的致病因子,利用反向遗传学技术研究毒力因子的致病方式将有助于相关预防及治疗药物的开发与利用。科研人员对新城疫病毒(N D V)不同分离株的研究发现,融合蛋白F上的裂解位点是病毒毒力强弱的关键［21], Peeters等［22]在拯救NDV弱毒株的研究中将cDNA上F蛋白裂解位点突变为强毒株的标志性序列并成功拯救具有强致病性的NDV重组毒株,该试验再次证明了F蛋白裂解位点与NDV致病性的重要关系且为探索强毒株与弱毒株之间的进化规律找到了新的研究方法。为了研究副黏病毒P基因编码产生的非结构蛋白V与病毒毒力的关系,研究人员利用反向遗传的方法构建了V蛋白表达受限的重组NDV,对重组NDV在鸡胚上增殖情况的研究发现,V蛋白除了会影响病毒本身的增殖能力可能还介导了病毒在宿主细胞中的致病过程［23]。

2.3 弱毒疫苗制备传统的弱毒疫苗制备大多是通过理化致弱或在异源动物或组织培养物中连续传代获得弱毒株,这种方法由于存在毒力返强、周期长且预期结果未知等风险,在应用上存在一定限制。而利用分子生物学方法如反向遗传技术对病毒基因进行适当的修饰从根本上对病毒的生物学特性进行改造,在不影响病毒正常复制的前提下降低其致病性且保留较高的免疫原性,无回复突变至毒力返强的风险,且大大地缩短了研发周期,获得可用于疫苗开发的致弱株。目前反向遗传技术是疫苗研发中较为可行的方法,其他病毒疫苗的研发已经提供了切实的例证,如禽流感疫苗的研发。

早期的RSV疫苗使用的弱毒株是化学方法筛选出的温度敏感型,尽管在RSV阴性血清的黑猩猩身上表现出高度的致弱现象,但在临床试验中该疫苗在部分儿童体内展现出了较高的复制能力与毒性,类似的情况也出现在其他候选疫苗中,安全有效的免疫原性与致弱性良好的疫苗株很难同时获得。为了解决这一问题,1999年White head及其同事［24]利用反向遗传学的方法对已有RSV弱毒株cpts248/ 404的L基因进行定点突变,获得了充分减毒的重组疫苗株,该试验的成功为本已遭遇到瓶颈的RS V弱毒疫苗开发找到了新的突破口。N-糖链是位于副黏病毒囊膜表面糖蛋白上的特殊结构,研究发现该结构与病毒侵入宿主细胞有关且影响着病毒的致病性,Panda等［25]利用反向遗传方法构建了HN蛋白N-糖链缺失的重组NDV病毒,对该重组病毒的进一步研究发现,缺失N-糖链并不会对病毒的复制能力产生显著影响且获得的重组毒株毒力要低于亲本株。PIV3是一种严重危害婴幼儿的呼吸道病原体,为了开发安全有效的PIV3减毒疫苗,研究人员利用反向遗传技术将PIV3囊膜表面糖蛋白的胞外区替换为PIV2弱毒疫苗的部分抗原结构,结果获得了充分致弱的重组毒株,为PIV3弱毒疫苗研发提供了技术基础。

2.4 嵌合病毒制备嵌合病毒是利用基因工程的方法人为创造具有多个亲本毒株生物特性的重组病毒。在自然环境中个别病毒也会发生重组现象,但人们对新出现重组病毒的生物学特性未知,有一些毒株的致病力会减弱但有一些可能会增强,甚至出现新的高致病性毒株,而利用反向遗传学方法创建的嵌合毒株由于亲本基因序列及生物学特性已知,因此获得重组病毒具有更高的可控性及安全性,另外部分寄生于不同物种之间的副黏病毒基因组较高的同源性以及种间差异对病毒复制的影响也为重组嵌合病毒的成功拯救以及安全使用提供了必要的先决条件。2000年,研究人员将BPIV3的F及HN编码基因替换为HPIV3并成功构建PIV3嵌合病毒rBPIV3-FHHNH,血清学试验表明:新获得的重组嵌合病毒可在灵长类动物身上有效诱导较高水平的HPIV3中和抗体［20],该重组病毒可开发为HPIV3候选疫苗及作为一种对抗其他病原的活疫苗载体。Buchholz等［26]通过反向遗传学将牛RSV囊膜表面糖蛋白F和G替换为人RSV F和G,获得重组人/牛嵌合RSV减毒重组疫苗,在黑猩猩身上的试验表明该重组疫苗是安全有效的,而该疫苗的成功构建也为新型人用RSV疫苗开发奠定了技术基础。

2.5 活载体疫苗副黏病毒作为活载体疫苗具有极大的优势。首先,由于是RNA病毒其复制阶段不存在DNA中间体因此不会整合到宿主基因组中;其次,副黏病毒可在多种细胞系中增殖,易于培养及大规模生产;另外,副黏病毒基因组可装载长度较大的外源片段且插入的外源蛋白具有较高的表达效率、稳定性及免疫原性,而反向遗传技术的出现使得外源片段的插入变得更为简便［19,27]。截至目前副黏病毒载体主要为人和动物的呼吸道病毒,如SeV、BPIV3、HRSV以及NDV等。Schmidt及其同事以人/牛嵌合PIV3弱毒株为载体成功表达RSV糖蛋白G以及F,新获得的重组病毒保留了PIV3载体病毒的致弱特点且可在灵长类动物身上有效诱导产生较高水平的PIV3与RSV抗体滴度［27-28],这意味着该毒株可被开发成为一种有效的人用PIV3/RSV二联疫苗来对抗目前影响婴幼儿呼吸系统的两种主要病原体。Liang等［29]将RSV F蛋白插入到嵌合PIV3毒株基因组不同蛋白编码序列之间,并以此来研究外源片段的插入位点与表达量的关系,结果表明除所有重组毒株增殖未受影响之外,当外源片段插入位置越靠近PIV3基因组3′端时其表达量越高且在F基因被插入到N-P基因之间、P-M基因之间以及HN-L基因之间时获得的重组病毒温度敏感性增强。Sawada及其同事［30]以重组麻疹疫苗株AIK-C为载体,将HRSV F基因(A2)插入到AIK-C P与M基因之间,诱导出的中和抗体可以对抗两个病毒亚群,在棉鼠试验中该重组毒株可赋予棉鼠较强的对抗HRSV-A亚群的能力,肺部平均病毒载量降低大于2.3 log;攻毒试验中的交叉保护力对于异源B亚群较弱,肺部病毒载量仅减少0.5 log。

所有的病毒载体都应符合三个要求:①疫苗株在体内能够被有效弱化;②疫苗能够对抗病毒的复制以及为上下呼吸道提供保护;③能够高效生产病毒种子。非人源载体如SeV和B PIV3的使用应避免机体对于该载体的免疫应答,因为这将会显著降低疫苗的效价。这些载体被认为对人类的影响较小,它们虽然可以感染人但不会造成严重疾病。即便如此,它们还是受宿主限制的,因此更深入的研究应当是放在这些载体转染人类细胞的能力以及对于目标的有效性上。

3 展望

随着反向遗传技术的不断完善和发展,越来越多的副黏病毒可以通过反向遗传技术来进行基因复制与表达调控机理、病毒与宿主间相互作用关系、病毒蛋白功能、致病机制、基因治疗研究、构建新型病毒载体表达外源基因和病毒重组疫苗制备等领域的研究,为更加深入了解这一类病毒的遗传进化、生物特点提供理论支撑,也有利于相关特效治疗药物和高效安全疫苗的研发从而更好防控这一类疾病提供新的研究方向和科学依据。同时,由于人工合成的具有生物活性的转录本,在病毒复制时可能发生重组和基因突变等,可能产生出不可预知的新病毒,因此在进行反向遗传相关操作时要充分考虑到生物安全问题,以避免基因污染,使这一技术更好地为人类服务。

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Update of reverse genetics for Paramyxoviruses

Ran Xuhua,Liu Yangyang,Wen Xiaobo*
(College of Animal Science and Veterinary Medicine,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Heilongjiang Daqing 163319)

Reverse genetics provides an important tool by which the function of gene of interest can be analyzed after the specific modification and deletion in the given gene is generated.Paramyxoviruses belong to single negative strand RNA virus family and development of the reverse genetics system,especially for single negative strand RNA viruses including paramyxoviruses,enables to facilitate the studies of viral protein function,pathogenic mechanism,as well as vaccine preparation based on recombinant viruses by reverse genetics.This paper reviews the newest research progress of reverse genetics for the members in Paramyxovirus family in an attempt to providing reference.

Reverse genetics;Paramyxovirus;Pathogenic mechanism;Viral rescue

S852.65

A

1672-9692(2016)10-0053-07

2016-08-02

冉旭华(1978-),女,博士,副教授,研究方向:分子免疫学。

闻晓波(1977-),男,博士,副教授,研究方向:分子病毒学。

黑龙江省农垦总局“十二五”重点科技计划项目(HNK125B-11-08A,HNK125B-11-02);“十二五”农村领域国家科技计划课题(2012BAD12B03-3);黑龙江八一农垦大学研究生创新科研项目(YJSCX2016-Y27)。