基因敲除技术在维生素D受体研究中的应用进展

肖硕　文九芳

·综述·

基因敲除技术在维生素D受体研究中的应用进展

肖硕文九芳

434020 荆州，华中科技大学同济医学院附属荆州医院药剂科(肖硕)；434000 荆州，荆州市第一人民医院药剂科(文九芳)

【摘要】基因敲除技术是一种新的生物遗传工程技术，在生物和医学领域的应用日趋广泛。维生素D通过维生素D受体的介导发挥多种生理作用，借助维生素D受体的基因敲除技术可更清楚地研究维生素D的多种生理功能，为以后的生物研究提供新的方向与方法。该文就基因敲除技术应用于维生素D受体后对机体肠道功能、抗肿瘤功能、心血管功能方面影响的研究进展作一综述。

【关键词】基因敲除技术；维生素D；维生素D受体

基因敲除技术是一种新型分子生物学遗传技术，它针对某个功能未知或者未明确的基因序列来改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失，屏蔽这部分功能，并进一步研究其对生物体造成的影响，从而推测出该基因的生物学功能[1]。维生素D与维生素D受体(VDR)是近年来儿科、心血管科、消化科研究的热门因子，维生素D在机体骨代谢之外的多种生物学功能已日益引起人们的重视，其功能的实现离不开VDR的介导。VDR是一种细胞内类固醇/甲状腺激素受体，维生素D的多种生理功能均通过其活性成分1,25-二羟基维生素D3[1,25-(OH)2-D3]与VDR结合介导调节生物体内的靶基因转录而实现。因此，深入研究VDR对明确维生素D的各种生理功能及其在生物医学上的作用有重要价值。传统的VDR研究基点在于VDR基因存在单个碱基突变，即单核苷酸多态性(SNP)，通过多聚酶链-限制性内切酶特异性酶切进行功能识别，研究其基因多态性。近年来，基因敲除技术发展逐渐成熟，对生物体内的VDR进行基因敲除有助于更清楚地研究其功能，对临床有重要意义。

一、基因敲除技术的原理与特点

基因敲除和基因嵌入技术是上世纪80年代末出现的最新外源DNA导入技术[2]。基因敲除技术类似于基因的同源重组，将外源DNA与受体细胞基因中序列相同或类似的基因发生同源重组，代替受体细胞基因组中该序列，整合入受体细胞的基因组中，属于外源基因在体内的定点整合,是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术[3]。除了同源重组外，基因的插入突变和RNA干扰(RNAi)技术同样可以达到基因屏蔽的目的。基因敲除技术克服了基因随机整合的盲目性与随机性，是一种理想的改造生物遗传物质的方法，为我们提供了全新的研究手段。目前，基因敲除技术在生物医学上的应用主要在于动物模型的建立，其中小白鼠的模型研究较为成熟，大型哺乳动物的基因敲除模型尚处于探索阶段[4]。

二、维生素D与VDR简介

维生素D为一类固醇激素，通过作用于细胞核内的特异性受体，与受体形成激素-受体复合物，激活或抑制含有维生素D反应元件的基因，影响DNA的转录，发挥多种生物学作用。人体缺乏维生素D不仅可表现为佝偻病和骨软化症，还可能引发癌症、心血管疾病、内分泌疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病及结核[5]。而研究维生素D 的功能，离不开对VDR的研究。VDR为亲核蛋白，能在多个器官与组织中表达，是介导维生素D的活性成分1,25-(OH)2-D3发挥生物效应的核内生物大分子超家族成员，维生素D的多种生理功能均通过VDR来实现[6]。1,25-(OH)2-D3激素信号分子在靶细胞上与VDR结合形成激素-受体复合物，作用于靶基因上的特定DNA序列，调控结构基因的表达[7]。VDR基因是1,25-(OH)-D3发挥生理效应的候选基因之一，采用新型的基因敲除技术研究VDR的基因表达，检测机体内该受体的表达对各种生理功能的影响，可以开辟新的研究维生素D及VDR的方向[8]。

三、基因敲除VDR后机体功能研究

1. 基因敲除VDR后机体的肠道功能

Cordin等[9]基因敲除小白鼠的VDR，以同窝繁殖未接受基因敲除的小鼠作为对照组，对2组小鼠肠道上皮细胞的裂解物用Ab099进行蛋白免疫印迹分析，发现对照组的VDR分析带明显，而基因敲除组的分析带几乎不可见，用共聚焦显微镜观察也发现基因敲除组肠道细胞表面无1,25-(OH)2-D3。他们进一步对从2组分离出的肠道细胞进行类固醇激素刺激的钙摄取试验，发现基因敲除组肠道细胞反应钝化或完全无反应，而对照组肠道细胞于5 min内钙摄取增强。因此他们得出结论，VDR的存在介导1,25-(OH)2-D3发挥生物活性，明显增强机体对钙的吸收能力。康红等[10]制备VDR和CaBP-D28k双基因敲除小鼠，他们用普通食物和高钙食物喂养野生型与双基因敲除后的小鼠，检测两者体内瞬时感受器电位V5(TRPV5)蛋白和 TRPV6蛋白的mRNA水平。结果显示，普通饮食下，双基因敲除小鼠尿钙的分泌和血清甲状旁腺激素水平高于野生型小鼠，但两者TRPV5和 TRPV6的表达无明显差异；高钙饮食下，基因敲除小鼠的血钙水平正常，但TRPV5和 TRPV6的表达降低。研究表明，上皮钙通道基因受钙和维生素D的调节,CaBP-D28k的缺失对两者无影响。肾钙的重吸收减少与TRPV5和TRPV6基因表达无关。

2. 基因敲除VDR后机体的抗肿瘤功能

Keith等[11]进行了系列实验，包括提取基因敲除VDR小鼠的细胞诱导稳定表达野生型或基因突变型VDR，以便研究VDR结合1,25-(OH)2-D3的功能、VDR配体的功能及VDR对生物功能的调控作用。PDGFB, VEGFA和NFKBI均为基因研究的靶点[12]。基因敲除VDR的细胞产生的点突变(W286R, R274L)导致小鼠对生理剂量下的1,25-(OH)2-D3耐受不明显，而对大剂量的1,25-(OH)2-D3反应明显，蛋白免疫印迹分析显示VDR产生的表达带明显减弱。基因敲除VDR的细胞的G46D点突变直接消除VDR上与1,25-(OH)2-D3的连接配基，从而产生生长抑制。因此，即使生物体在VDR蛋白、辅酶因子、靶点基因等方面存在差异与变化，人类和小鼠引起抗癌反应的VDR信号轴均是高度保守的[13]。有学者发现，基因敲除VDR的雌性小鼠更容易患生殖系统肿瘤[13]。有研究显示，基因敲除VDR后3种乳腺癌标志物——雌激素受体、孕激素受体和原癌基因人类表皮生长因子受体2(HER2)会出现减少或缺失，提示VDR在介导机体吸收维生素D和减少女性乳腺癌风险方面有重要作用[14]。

3.基因敲除VDR后机体的心血管功能

有研究显示，野生型小鼠和基因敲除VDR小鼠主动脉中内皮型一氧化氮合酶、内皮素-1基因表达产物均有表达，但与野生型小鼠比较，前者在基因敲除VDR的小鼠中的表达明显少,后者的表达则明显高，且基因敲除VDR小鼠的收缩压、舒张压明显高于野生型小鼠(P均<0.05)[16-17]。Bae等[18]对野生型和基因敲除VDR小鼠分别进行了假性心肌梗死手术，术后4周观察两者的手术情况，结果显示，基因敲除VDR小鼠的生存率和心脏功能等情况较野生型小鼠差，且细胞凋亡、炎症和纤维化更严重，因此他们得出结论，VDR对心肌梗死后细胞有间接保护作用。

四、小结与展望

作为一种新型的生物技术，基因敲除技术有助于建立生物模型、研究疾病的分子机制及进行基因治疗。在传统意义上，维生素D的主要功能为调节钙磷代谢与骨代谢平衡，但近年来，我们发现其尚有其它多种的生物功能，例如介导抗炎反应、抗肿瘤反应、免疫调节、心血管调控等。如上文所述，对生物体内的VDR进行基因敲除有助于更清楚地研究维生素D的生理功能。但基因敲除技术仍存在某些不足，一方面，基因敲除技术不易准确使用，基因重组的随机性依然很大，会对实验结果的准确性造成影响；另一方面，维生素D作用范围广，较多相关的机制尚未明确，仍有待进行更大量的临床研究，因此，基因敲除技术在VDR研究中的应用仍需深入。

参考文献

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Application progress in gene knock-out of vitamin D receptor

XiaoShuo,WenJiufang.

DepartmentofPharmacy,JingzhouHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology，Jingzhou434020，China

【Abstract】Gene knock-out, as a novel type of genetic engineering technology, has been more and more widely applied in the field of biomedicine. Vitamin D plays a variety of physiological roles through the mediation by vitamin D receptor. Application of gene knock-out of vitamin D receptor can explicitly investigate multiple physiological functions of vitamin D, providing orientation and method for the biological research in the future. In this paper, the effects of gene knock-out of vitamin D receptor upon intestinal function, anti-tumor function and cardiovascular function were reviewed.

【Key words】Gene knock-out technology; Vitamin D; Vitamin D receptor

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.06.002

(收稿日期：2016-05-04)(本文编辑：洪悦民)