貉肉中金刚烷胺残留的检测方法

2016-02-20李宏娟张嘉楠曹秀梅林艳青杜顺丰河北省秦皇岛市农产品质量安全监督检验中心

中国畜牧业 2016年7期

关键词：氯乙酸小柱乙腈

文│李宏娟张嘉楠曹秀梅林艳青杜顺丰（河北省秦皇岛市农产品质量安全监督检验中心）

貉肉中金刚烷胺残留的检测方法

文│李宏娟张嘉楠曹秀梅林艳青杜顺丰（河北省秦皇岛市农产品质量安全监督检验中心）

项目名称：河北省秦皇岛市科技局项目（项目编号为：201502A 049）

金刚烷胺又叫三环癸胺、三环葵胺、盐酸金刚烷胺，是国际医学界公认的对流感病毒有抑制作用的抗病毒药物，我国从20世纪90年代末开始在兽医临床上用于动物病毒病的预防和治疗，但是金刚烷胺作为抗病毒药用于兽医临床缺乏科学规范、安全有效的实验数据。

金刚烷胺用于治疗流感能使流感病毒发生变异，并使疫情进一步蔓延，造成抗金刚烷胺病毒的流行，对公共卫生安全造成极大威胁。同时，金刚烷胺比较明显的副作用是用药后产生呕吐以及神经症状，而且其在体内降解代谢的量极微。若长期食用残留量高或被此类药物污染的食品，会在人体积累，导致蓄积中毒，对中枢神经系统造成不良影响。因此，2005年农业部第560号公告和农医发[2005]33号文，规定禁止金刚烷胺等抗病毒兽药生产、经营和使用。

河北省秦皇岛市昌黎县被誉为“中国养貉之乡”，每年貉出栏量可达1100万只。貉的用途一直以毛皮为主，貉胴体现多被废弃或加工成人工饲料。据李时珍《本草纲目》记载：“貉肉甘温无毒，主治元脏虚涝及女子疲惫。”据报道，貉肉营养成分比较高，蛋白含量高于福建猪肉，脂肪低于北京猪、牛、羊肉，胆固醇含量低于猪肉、羊肉和兔肉，蛋白生物价E/T比值接近于牛肉，有很高的食用价值。所以对貉肉的可食性加以开发利用，不仅可以增加肉食来源，而且还可以增加养貉业的收入，促进养貉业的发展。

建立貉肉中金刚烷胺残留检测方法，对有效监控该药在貉的养殖中的应用、推广貉肉食用的食品安全性具有重要意义。目前动物源性食品中金刚烷胺的残留检测，国内外尚无法定检测标准。本文采用甲醇-三氯乙酸提取、MCX小柱净化，BEH C18色谱柱分离后，用超高效液相色谱-串联质谱仪对金刚烷胺进行检测。该方法快速、科学、灵敏、可靠，用于实际样品的检测，结果满意。

一、实验部分

1.仪器与试剂。UPLC-Xevo TQ型超高效液相色谱-串联质谱仪（美国Waters公司），高速冷冻离心机，氮空吹扫描仪，Oasis MCX固相萃取小柱（3毫升/6毫克），甲醇、甲酸、乙腈（色谱级，进口），异丙醇，三氯乙酸，乙腈，浓氨水，盐酸金刚烷胺对照品（中国兽医药品监察所）。

2.标准溶液的配制。标准储备液：准确称取盐酸金刚烷胺0.005克于50毫升容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成质量浓度为100微克/毫升的标准储备液，于4℃下避光储存3个月。

标准中间液：精密吸取上述储备液0.5毫升于50毫升容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，制成质量浓度为1.0微克/毫升的标准工作液，于4℃下避光储存1个月。

3.样品提取和净化。提取：称取2.0克均质貉肉样品于50毫升离心管中，加入10毫升1%三氯乙酸-甲醇（1∶1，v/v）提取液，充分涡旋混匀1分钟，4℃下10000转/分钟离心10分钟；转移上清液至新的50毫升离心管，加入10毫升正己烷，混匀，10000 转/分钟离心10分钟，除去上层，取下层5毫升净化。

净化：MCX小柱分别用3毫升甲醇、3毫升水活化；5毫升样品过柱；3毫升2%甲酸水、3毫升100%甲醇淋洗，抽干；3毫升5%氨化甲醇∶异丙醇（4∶1）洗脱。收集洗脱液，45℃水浴氮气吹干。1毫升0.1%甲酸水∶乙腈（9∶1）溶解定容，0.22微米滤膜过滤，滤液供UPLC-MS-MS分析。

4.色谱条件。色谱柱：UPLC BEH C18色谱柱（100×2.1毫米，1.7微米，美国Waters公司）。

流动相A：乙腈；流动相B： 0.1%甲酸水溶液；流速：0.3毫升/分钟；柱温：40℃；进样量：5微升；运行时间：6分钟。梯度洗脱见表1。

5.质谱条件。电喷雾离子源正离子模式(ESI+)；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压：3.5千伏；雾化气温度：400℃；驻留时间（Dwell time）：0.161秒；监测离子对、锥孔电压（Cone）和碰撞能量（Collision）等参数见表2。

二、结果与讨论

1.提取溶剂的选择。本文考察了0.5%三氯乙酸-乙腈（1∶1、v/ v）、1.0%三氯乙酸-乙腈（1∶1、v/ v ）、0.5%三氯乙酸-甲醇（1∶1、v/ v）、1.0%三氯乙酸-甲醇（1∶1、v/ v）四种溶剂。

实验结果表明，1.0%的三氯乙酸-甲醇和1.0%的三氯乙酸-乙腈提取液沉淀蛋白的能力明显优于0.5%三氯乙酸-乙腈和0.5%三氯乙酸-甲醇提取液，由于1.0%的三氯乙酸为提取液提供了更好的酸性环境，更有助于目标物在MCX固相萃取小柱上附着，所以含有1.0%的三氯乙酸的提取液的回收率（80%左右）也高于含有0.5%的三氯乙酸的提取液（60%左右）。1.0%的三氯乙酸-甲醇与1.0%的三氯乙酸-乙腈回收率差别不明显，但是1.0%的三氯乙酸-甲醇混合溶液作为提取液，提取后的溶液更澄清，而且甲醇的价格比乙腈低廉、生物毒性也低于乙腈，所以选择1.0%的三氯乙酸-甲醇作为貉肉组织中金刚烷胺的提取溶剂。

表1 金刚烷胺洗脱梯度

表2 金刚烷胺多反应监测质谱参数

为了降低基质干扰、富集目标物、提高检测灵敏度，本研究采用固相萃取净化法，比较了 Waters Oasis HLB（3毫升/60毫克）、Waters Oasis MCX（3毫升/60毫克)、Waters Oasis MAX（3毫升/60毫克）、CNWBOND SCX（500毫克，3毫升）和传统的C18小柱的净化效果。结果表明，金刚烷胺在传统C18 小柱上几乎无回收，在Waters Oasis MCX、Waters Oasis HLB、Waters Oasis MAX和CNWBOND SCX小柱上均有不同程度的回收，其中Waters Oasis MCX 的回收率均最高。最终实验选择采用Waters Oasis MCX（3毫升/60毫克）固相萃取小柱净化样品。

2.液相条件的优化。本实验选择Waters UPLC BEH C18色谱柱、0.1%甲酸水和乙腈为流动相对金刚烷胺进行分离，通过调节流动相比例，发现相同浓度样品采用梯度洗脱比等度洗脱的响应提高2倍以上。而且梯度洗脱中，在金刚烷胺出峰后流动相保持60%乙腈冲洗色谱柱1分钟然后逐渐降到初始浓度，可以充分洗脱出色谱柱中残留的大分子蛋白，避免了长期使用时杂质在色谱柱中产生沉淀积累，影响分离效果。柱温箱温度选择40℃，可以避免环境温度对柱温的影响导致保留时间的波动，保证保留时间的稳定。

3.质谱条件的优化。由于金刚烷胺含有氨基，容易得到H+而形成稳定的[M+]+准分子离子，因而选择ESI正离子方法进行监测。将500纳克/毫升的标准溶液以流动注射的方式在正离子模式下进行母离子扫描，确定金刚烷胺的分子离子m/z 151.93。然后对其子离子进行全扫描，碎片离子主要为m/z 135.04、m/z 93.01。因为m/z 135.04信号强且较为稳定，故以135.04为定量离子。

驻留时间（dwell time）影响检测的精确度和灵敏度。当调节驻留时间为0.161秒时，得到的离子的准确度高，重现性好，峰形明显变好。

4.液相色谱线性考察及添加回收试验。

（1）标准曲线。分别配制盐酸金刚烷胺质量浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50微克/升的系列混合标准溶液，在选定的色谱质谱条件下进行测定，以定量离子的峰面积对质量浓度进行线性回归计算，在0.1～50微克/升的范围内标准曲线方程为Y=2757.67X+54.1375，线性关系良好，其相关系数r2为0.999，详见图1。

（2）回收率和精密度。貉子肉中添加不同浓度的盐酸金刚烷胺，前处理后由高至低检测，在保证同时分离出定量离子和定性离子的前提下，确定貉子肉中盐酸金刚烷胺的检出限为0.2微克/千克，定量限为0.5微克/千克。

貉肉的添加回收和精密度试验，添加水平为 0.5、1.0、2.0微克/千克，每个添加浓度重复三次试验，添加、混合后静置使样品溶液被样品充分吸收。然后按照本方法进行样品处理和测定，每个添加样品测定6次，结果阳性添加样品的回收率在75%～91%，平均回收率在81.8%～86.9%，精密度在1.9%～3.5%（见表3）。各特征离子质量色谱图见图2～图4。

表3 貉肉中盐酸金刚烷胺的回收率和精密度

三、结论

本文建立貉肉中盐酸金刚烷胺的液相色谱-串联质谱测定方法。貉肉样品经1%三氯乙酸-甲醇（1∶1, v/ v）提取，经固相萃取柱净化、浓缩后, 采用超高效液相色谱-串联质谱法在正离子模式下检测金刚烷胺。本实验采用外标法进行定量, 方法检测限为0.2微克/千克，定量限 0.5微克/千克，金刚烷胺平均回收率为81.8%～86.9%，相对标准偏差为 1.9%～3.5%（n=3）。本方法灵敏度高、准确性好、适用于貉肉中金刚烷胺残留的检测。