液体活检在肝癌早期诊断与预后判断中的临床价值

刘小龙

（福建医科大学孟超肝胆医院，福建省肝病科学研究中心，福建福州市350000）

液体活检在肝癌早期诊断与预后判断中的临床价值

刘小龙

（福建医科大学孟超肝胆医院，福建省肝病科学研究中心，福建福州市350000）

据统计中国肝癌死亡率为30.81/10万（2015年数据）[1]，居我国恶性肿瘤死因第三位。大部分肝癌病人在被确诊时已处于中晚期且伴有不同程度的肝硬化，导致手术切除率低，复发率高，预后差。目前蛋白质类血清标志物筛查（AFP/AFP-L3）及影像学诊断，是肝癌诊断以及判定术后（或介入治疗后）复发转移或肿瘤负荷的主要手段[2]，但二者均存在灵敏度不高或特异性不足等问题，使其不能为肝癌病人提供准确的诊断及预后信息。

液体活检作为肿瘤精准医疗的重要手段，已成为肿瘤学研究领域的前沿研究热点。液体活检指检测体液中捕获到的游离肿瘤信息，进而反映病人的全身肿瘤信息。与传统的活检技术相比，其具有多次低创伤反复采样、可实时"更新反馈"肿瘤负荷、克服肿瘤异质性、指导个性化用药等优点，在临床上蕴藏着广阔的应用前景。目前液体活检主要包括循环肿瘤DNA检测，循环肿瘤细胞检测及外泌体检测。

1 循环肿瘤DNA

游离脱氧核糖核酸(Cell Free DNA，cfDNA)是指存在血浆或血清、脑脊液等细胞外游离状态的核酸片段，约160～180 bp，是细胞DNA在生理或病理条件下降解的产物。目前研究表明肿瘤病人外周血中存在的cfDNA显著高于健康人群，并且这些cfDNA携带有患者的肿瘤相关基因信息（包括肿瘤基因的异常突变，甲基化和拷贝数异常等），称之为循环肿瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）。其主要来源于坏死的肿瘤细胞，循环肿瘤细胞，凋亡的肿瘤细胞及来自于肿瘤细胞的外分泌小体。

现阶段研究表明循环肿瘤DNA是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段。在肝癌的发生发展阶段，cfDNA的含量与肿瘤的发展情况和预后密切相关：cfDNA含量通常在肝癌晚期或者大肝癌患者中较高，而在肝癌早期或者小肝癌患者中较低；术后cfDNA含量较高的患者预后较差，更容易发生复发转移[3]。因此，肝癌患者血液中cfDNA的含量可用于肝癌的诊断和预后，但这个方法只计算总体cfDNA的浓度，并没有区分ctDNA的遗传改变特征，灵敏度和特异性并不高。而通过检测肝癌患者血液中癌症特异的基因突变或表观遗传学变化可以为肝癌的诊断提供更为精确的标志物。如TP53基因作为一种经典的抑癌基因，突变热点少，稳定性高，且该基因的第249位丝氨酸突变常发生于化学致癌物黄曲霉毒素诱发或乙肝病毒感染所引发的肝癌中，在肝癌发生早期即可检出。因此血液中TP53基因第249位丝氨酸的ctDNA可作为肝癌早期诊断的标志物[4-6]。此外，检测外周血中ctDNA的表观遗传学变化可作为肝癌早期诊断的另一手段，如ctDNA中RASSF1A，p15和p16的甲基化检测可作为肝癌诊断和预后的有效生物标记物，检测敏感度可达84%，特异度达94%，可比现在的检测手段更早地诊断其患肝癌的风险[7-8]。随着测序技术的进步，在临床上精确检测肝癌ctDNA的特异性变化已经成为可能；根据肝癌病人的ctDNA信息分析，也可用于指导个性化用药及治疗疗效的监测等。

2 循环肿瘤细胞

循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells,CTCs）是指由于自发或诊疗操作使得一部分癌细胞离开原发灶进入血液，随血液循环到处游走，进入血液循环的大部分癌细胞都会死亡，只有小部分高活力、高转移能力的细胞存活下来，它们相互聚集形成癌栓，在一定条件下转移形成新的病发灶。

目前国际上主要采用FDA批准临床运用的Cell Search系统，是基于上皮细胞粘附分子EpCAM（Epithelial cell adhesion molecule)抗体的策略来分选富集CTCs[9]。临床上定义外周血中CTCs≥2个/7.5 mL为CTCs阳性[10]。CTCs检测在肝癌早期诊断中具有重要意义，传统的影像学检查只能检测出直径大于1 cm的肿瘤，而利用外周血中CTCs检测的方法，肿瘤在只有1 mm左右时便可检出。另外CTCs数量还是无病生存期（DFS）和总生存期(OS)的预测因子，CTCs数量越多，预后越差，生存期越短[11-12]。因而靶向CTCs可作为肝癌切除根治切除术的新辅助治疗策略，杀死术后残存的CTCs细胞，减少CTCs数量，可降低肝癌复发转移的风险。

3 外泌体

外泌体（Exosome）指一类由活细胞通过多泡体与细胞膜融合分泌至细胞外隙或体液中直径为40～100 nm的小囊泡体，主要有蛋白质、RNA、microRNA和DNA等，在细胞通讯、细胞迁移、血管新生、免疫反应和肿瘤发生发展等许多生理和病理过程方面发挥重要的作用[13-14]。肿瘤细胞可以通过分泌外泌体影响肿瘤周边的微环境及不同的受体细胞，如诱导成纤维细胞分化成肌成纤维细胞，减少I型胶原蛋白的合成等进而促进癌症的复发转移。

现有的研究数据表明外泌体可以成为肝癌早期诊断及预后的一类新型标志物。如外泌体中的microRNA（miR-718,miR-221,miR-191）等已经被证明在肝癌病人血浆外泌体中的分布与正常人显著不同[15-16]。它们可通过抑制下游靶基因的表达及信号转移参与肝癌的发生发展，可作为肝癌标志物或治疗靶标。但现在对肝癌的外泌体研究还很有限，对外泌体如何参与肝癌发生发展的机制仍需进一步研究。

4 展望

随着高通量测序、精准医学等研究的进展，液体活检必将在肝癌诊断、预后判断中发挥重要的作用。但目前将其应用于临床还有一些问题需要解决：如循环肿瘤细胞尚无检测“金标准”，灵敏度、特异度不足；还不清楚ctDNA与不同癌症之间的关系，即使检测到突变的ctDNA，但却不知道其来源。基于CTCs、ctDNA、外泌体的检测因其本身的特性而各有利弊，综合利用上述手段将促进肝癌的早期诊断及诊疗方案的实时精准反馈与评估，进一步降低肝癌的死亡率，提高其远期生存率。

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3.Openshaw MR,Harvey RA,Sebire NJ,et al.Circulating Cell Free DNA in the Diagnosis of Trophoblastic Tumors [J].EBioMedicine,2016,4:146-152.

4.Gouas DA,Villar S,Ortiz-Cuaran S,et al.TP53 R249S mutation,genetic variations in HBX and risk of hepatocellular carcinoma in The Gambia[J].Carcinogenesis,2012, 33(6):1219-1224.

5.Kirk GD,Camus-Randon AM,Mendy M,et al.Ser-249 p53 mutations in plasma DNA of patients with hepatocellular carcinoma from The Gambia[J].J Natl Cancer Inst, 2000,92(2):148-153.

6.Kirk GD,Lesi OA,Mendy M,et al.249(ser)TP53 mutation in plasma DNA,hepatitis B viral infection,and risk of hepatocellular carcinoma[J].Oncogene,2005,24(38): 5858-5867.

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9.Zhang Y,Li J,Cao L,et al.Circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma:detection techniques,clinical implications,and future perspectives[J].Semin Oncol,2012, 39(4):449-460.

10.Sastre J,Maestro ML,Puente J,et al.Circulating tumor cells in colorectal cancer:correlation with clinical and pathological variables[J].Ann Oncol,2008,19(5):935-938.

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（2016-7-30收稿）

R446.11

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.05.004

刘小龙，男，博士生导师。E-mail:xiaoloong.liu@gmail.com