异种骨移植与大段骨缺损修复现状及研究进展

赵文博，张　智，阳　波，叶永杰

(遂宁市中心医院，四川 遂宁　629000)



异种骨移植与大段骨缺损修复现状及研究进展

赵文博，张智，阳波，叶永杰

(遂宁市中心医院，四川 遂宁629000)

由创伤、肿瘤、代谢疾病等所致的大段骨缺损的治疗一直是临床难题，而骨移植为目前广泛采用的治疗方式。目前有多种骨移植物可供选择，它们各有优缺点，其中的异种骨因其特有优势在创伤骨科以及肿瘤骨科中发挥着日益重要的作用，具有较为突出的临床和学术意义。然而目前尚未完全解决异种骨抗原性、移植后的免疫反应、制作工艺等问题。如何制作出更符合临床应用标准的异种骨移植物是相关领域的研究重点。本文就上述问题对近年来的研究成果进行综述，以期为异种骨移植的进一步研究与应用提供参考。

骨移植；骨缺损；异种骨；骨组织工程

优先数字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1688.R.20160628.1836.008.html

由创伤、肿瘤、代谢疾病等所致大段骨缺损的治疗一直是临床难题[1]，其主要治疗方式为骨移植，材料包括自体骨、同种异体骨、人工骨、异种骨等。骨移植已成为仅次于输血的同种异体组织移植，每年有超过两百万例骨移植手术在全世界范围内开展[2]，其所带来的临床价值及经济效益促使人们不断探索更为有效、合理的骨移植物。自体骨移植依然被视为大段骨缺损治疗的“金标准”[3-4]，然而因来源限制、为获取移植物而额外增加的手术创伤、术后疼痛和并发症等[5]缺点，限制了自体骨的临床应用。改良后的同种异体骨尽管更符合骨移植物标准[6]，却存在增加疾病传播的风险、骨诱导能力和生物力学性能较差、耗费较高等缺点。人工骨来源广泛并具有免疫原性低的优点，但其理化性质和生物性能无法企及天然骨，同时其降解吸收也难以控制，临床应用环境还不够成熟。以小牛骨、猪骨为代表的异种骨在修复骨缺损方面具有其独特的优势[7-8]。异种骨来源广泛，制造成本低，易于获得和加工，由于骨质中磷灰石的结构在不同种属间类似，较于人工骨，异种骨可形成多孔隙三维结构，有着更好的生物力学性能和骨传导性[9]，作为天然骨移植材料有着巨大潜在临床应用价值。然而异种骨的应用有赖于消除其免疫原性，同时保存成骨和骨诱导能力，这也给异种骨移植相关研究提出了挑战。本文就异种骨的免疫原性、制备方式、重组等方面的研究进展进行综述。

1　异种骨移植物的免疫原性及免疫排斥

异种骨中含有的抗原主要为：α-半乳糖基抗原(α-galactose base antigen,α-Gal)、主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)、骨髓、血液及胶原蛋白[10]，其中以α-Gal和MHC为主。此前研究已表明，α-Gal是影响异种骨移植存活的最为重要的抗原，为公认的普遍存在于灵长目以外的哺乳动物体内的异种抗原，其可以引起补体激活、超急性免疫反应以及急性异种血管排斥反应[11-12]； MHC为骨细胞表面的糖蛋白抗原，包括MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ。Feng等[13]研究表明，猪骨组织中α-Gal主要分布于皮质骨和髓质骨的骨细胞和成骨细胞表面，MHC-Ⅰ存在于骨髓细胞、骨细胞、成骨细胞的表面，MHC-Ⅱ只存在于骨髓细胞表面。

除此之外，尚有其他组分参与到免疫排斥中，Sun等[14]通过将兔异种骨移植到已注射白介素(interleukin,IL)-17中和抗体的小鼠中，发现IL-17和IL-23参与到异种骨移植的免疫排斥中，其中IL-17/核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand, RANKL)通路可能在异种移植骨骼重吸收过程中起关键作用。

异种骨引起的免疫排斥反应主要有2种：(1)体液免疫。α-Gal抗原主要通过间接识别途径与天然存在人体血清中的抗体相结合，其所介导的细胞毒效应导致血管内皮细胞溶解、血栓形成、炎性反应等免疫排斥。(2)细胞免疫。异种骨植入体内后，集体通过免疫细胞对抗原进行摄取、处理以及提呈，进而引起T淋巴细胞和B淋巴细胞的活化，发生细胞免疫。异种骨移植为游离骨组织移植，并不直接暴露于血液中，因而不会出现明显的超急性排斥反应。细胞介导的免疫排斥在此过程中占主要作用。

由异种抗原引起的免疫排斥反应依然是异种骨移植中最大的障碍。Seebach等[15]发现，异种骨移植后初期其内存活的细胞具备成骨能力，但由于免疫排斥作用以及NK细胞介导的细胞毒性作用，其移植物中的细胞可被杀死，早期成骨亦会被吸收。异种骨移植须在不影响成骨能力的前提下去除具有抗原性的蛋白和脂质，因此如何更好地制备异种骨移植物以及去除其中抗原与异种骨移植成功率息息相关。

2　异种移植物的制备

异种骨的制备是异种骨移植取得成功的前提和基础，其目的在于尽可能减少或去除其中的抗原成分，弱化亦或是消除免疫排斥反应，同时保留其原有的三维形态结构和生物力学性能，提高骨移植的安全性和有效性。异种移植物的来源理论上不受限制，现今较常见的有猪骨和小牛骨，其主要制备方式有物理方法(低温冷冻、高温煅烧、超声)、化学方法(脱脂、脱蛋白、脱细胞)以及多种方式联合运用等。

低温冷冻方法是目前用于制备异种骨移植物较常用的方法之一。通过深低温冷冻技术破坏细胞表面的抗原结构，降低免疫原性，但同时也会改变移植物的骨诱导活性且单用此法无法完全去除免疫原性。Ribeiro等[16]回顾了阿雷格里港医院2000—2013年行髋关节置换翻修术中运用冻干异种骨治疗髋臼骨缺损的14例患者的情况，发现其中85.7%的患者有新骨形成，并覆盖了61.79%的骨缺损区域，均未出现炎症反应和排异反应，证实冻干骨有良好的骨诱导能力。Jähn等[17]采用快速冻融循环、X线照射及紫外线照射等3种方法处理羊骨，结果显示快速冻融循环处理异种骨简单易行，耗时较少，效果可靠。

高温煅烧的优点主要在于可降低或彻底去除异种移植物的免疫原性，且保留天然骨原有无机盐骨架以及三维框架结构，但会对支架的生物力学特性产生影响，如脆性增大，力学强度及成骨能力较低。有研究显示，当煅烧温度超过600 ℃时异种骨抗压性能会增强，脆性增加，但相应的降解性会下降。

目前物理方法制备异种骨的研究热点主要集中于低晶度材料，因其有更大的表面积、孔径和容积。这些特性对于成骨细胞的生长、移植材料的降解以及骨的再生都极为重要。Go等[18]用猪股骨分别经过400 ℃以及1 200 ℃环境煅烧后(低温煅烧后的移植物结晶度较低)，形成不同结晶度的移植物，并被磨碎至直径小于1 mm的颗粒，而后移植到颅骨部分缺损的大鼠中，发现低结晶度移植物有更多成骨细胞黏附和更好的成骨性能，新生骨密度更高。

化学方法主要包括脱脂和脱蛋白等。脱脂可去除移植物哈弗氏管腔中的脂肪以及脂蛋白成分，常用的有氯仿/甲醇混溶剂、乙醚、超临界CO2等。传统化学试剂有一定毒性，不利于骨细胞黏附及骨再生；超临界CO2目前对设备及成本要求较高，尚难以普及。脱蛋白法会使部分胶原蛋白变性，改变其力学强度。

为了制备出更好的异种骨移植物，目前更为提倡物理化学方法的联合使用。Cho等[19]将小牛骨颗粒经过脱脂、清洗，并浸润于含次氯酸钠的溶液中，此后干燥并与次氯酸钠一同加热至1 000 ℃而制备成的新型异种骨，结果表明其有更高的离子溶解度、较低结晶度以及良好的骨传导性，是一种具有发展潜力的异种移植物。

异种骨移植降低抑或消除免疫原性的另一种方式为清除表面抗原物质，Park等[20]研究发现，经α-半乳糖苷酶处理后的猪异种骨可以降低α-半乳糖表位，对于C57BL/6 α-半乳糖敲出的小鼠而言，这种抗原的减少可以显著降低体液免疫反应。

可见，单纯物理方式以及物理化学联合的方式制备移植物均可获得较为满意的支架性能，较于单纯化学方式制备的移植物有更好的生物相容性、骨诱导性等。新型制备方式的研发也为异种骨的制备提供了更多选择，且取得了较好效果。

3　重组异种骨

以上所述传统方式制备异种骨移植物的过程中，尽管降低了免疫原性，但也不可避免地影响到移植物的骨诱导性能，尚且无法达到临床应用需求，更难以媲美自体骨。近年来对于异种骨移植，如何在提高力学性能的同时而又不影响其生物学性能、早期恢复肢体功能已成为主要研究方向[21]，其中的热点又集中于重组异种骨，即将某些促进骨生长的因子、细胞等与已处理过的异种骨相结合而成复合物，以增加骨诱导成骨的能力。

3.1骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein， BMP)最初是因其具有促进异位骨形成的能力而命名，为异种多功能生长因子，在肢体生长、软骨内骨化、骨折早期及软骨修复时表达，通过促进多功能间质细胞分化为成骨细胞和成软骨细胞，对骨骼的再生修复和胚胎发育起重要作用。具有较广阔临床应用前景的是重组人BMP-2和BMP-7，较早应用于脊柱融合、骨缺损等的治疗。

Yon等[22]用BMP-2缓释组分承载于猪异种骨中制成新型复合，用于治疗骨缺损，相较于使用单纯猪异种骨的对照组，实验组有更好的局部骨生成，尤以中央区显著，表明BMP-2具有良好成骨效应。Long等[23]用猪异种骨复合BMP制成重组异种骨实验表明，将其应用于修复兔桡骨大段骨缺损，此种复合骨保持了其天然孔架结构和成分，具有较强的生物力学性能和骨传导性，可诱导大量间充质细胞增殖分化，增强骨修复能力。除此之外，重组人BMP(rhBMP)-7也被证实有助于骨生成和骨传导，主要用于治疗骨折不愈合[24]。3.2脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells， ASCs)是一种具有自我更新能力、拥有可塑性和多向分化潜能的多功能干细胞[25]，具有较强的成骨分化能力，可加速骨愈合，治疗骨缺损[26]。

Wilson等[27]以下颌骨缺损达10 mm的猪为模型，将脂ASCs直接注入局部骨缺损部位和经耳静脉注射作为实验组，单纯注射培养基为对照组，在术后2周和4周运用X线扫描、荧光显微镜检查、CT等评估骨愈合情况，证实局部骨缺损直接注射ASCs组骨愈合更好，X线和CT结果示骨密度更高，表明ASCs可以促进骨愈合，其对治疗骨缺损有一定潜能。Pelegrine等[28]将新鲜骨髓基质以及纯骨髓单核细胞分别与异种骨支架结合，再用单纯异种骨作为对照，用于修复兔的顶骨缺损，发现富含新鲜骨髓以及骨髓单核细胞的异种骨在促进骨生成方面均较对照组有明显改善，尤以富含骨髓单核细胞的实验组更为显著，其矿化区域的组织形态定量分析较其余2组有更高百分比。可见，间充质干细胞是一种极具发展潜能的可用于促进骨缺损愈合的天然材料，其与异种骨的复合也是未来的研究方向。

目前而言，部分重组异种骨已在临床中展开应用，为骨缺损治疗提供新的选择，其中以口腔医学临床应用较为广泛，而整形外科相关报道较少。Lad等[29]研究者统计了美国2002—2011年脊柱融合术相关资料，以比较BMP重组异种骨与自体髂骨移植临床应用趋势，结果表明BMP重组异种骨移植因其可改善疗效和缩短住院时间，临床应用逐渐增加。Hesse等[30]将脱细胞小牛骨质与患者自体骨髓联合培养形成复合异种骨，用以修复胫骨远端骨缺损达72 mm的患者，并辅以髓内钉固定，患者术后6周即可行走，2年随访期内未见任何异常。

异种骨移植的临床应用中目前也存在一定缺陷。Naohiro等统计了Scott and White Health Care System 2006—2012年行足踝重建手术患者的资料，以比较小牛异种骨与非异种骨(自体骨和同种异体骨)之间治疗骨缺损术后愈合率的差异，发现移植术后48周非异种骨不愈合率仅为5%，而异种骨移植达58%，较后两者明显升高。

4　总结与展望

骨丢失、骨缺损的外科治疗依然是重难点，已有众多修复材料可供选择。异种骨作为替代材料的一种，因其低成本、易于获取、有良好的骨传导和生物力学性能，并具备天然的三维孔架结构等特性而被广泛关注，有成为理想骨移植材料的潜能。尤其是随着异种骨衍生材料研究的进一步深入，复合异种骨的临床应用逐渐展开，异种骨作为治疗骨缺损方式之一逐渐得到重视和认可。但异种骨免疫原性的去除以及制备依然对异种骨研究提出了巨大挑战。

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2015-08-25)

叶永杰，1312653816@qq.com

R687.3+4

A

10.11851/j.issn.1673-1557.2016.04.002