miR-34a逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药性及其机制

刘明明　刘永侠　付子毅

(东南大学附属中大医院，江苏　南京　210000)



miR-34a逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药性及其机制

刘明明刘永侠付子毅1

(东南大学附属中大医院，江苏南京210000)

摘要〔〕目的探讨过表达miR-34a对非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂(DDP)耐药性的影响及可能机制。方法成功构建过表达miR-34a的真核载体pCDNA3.1+miR-34a后，将A549/DDP细胞分为对照组(无转染)、空转染组(转染空质粒)和过表达组(转染pCDNA3.1+miR-34a)，采用实时荧光定量PCR(qPCR)法检测转染24、48、72及96 h后各组miR-34a水平；给予不同浓度DDP(2、4、8、16、32和64 μg/ml)处理48 h后采用CCK-8法比较各组对DDP的敏感性，流式细胞仪PI/Annexin V双染法检测各组转染48、96 h后的凋亡率，分别采用Western印迹检测各组转染48、96 h后常见耐药基因的表达情况。结果A549/DDP细胞的miR-34a水平均低于其亲本细胞A549和正常支气管上皮细胞系HBE(P<0.05)；与其余两组相比，过表达组转染后的miR-34a水平升高，且对A549/DDP细胞的增殖抑制率升高(P<0.05)；过表达组的半数抑制浓度均低于其余两组，过表达组转染48、96 h后的凋亡率高于其余两组，而转染48 h后的P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白1及肺耐药相关蛋白的水平低于其余两组(P<0.05)；对照组和空转染组以上指标的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论A549/DDP细胞中miR-34a水平较低，通过真核载体将其过表达后可抑制增殖率并提高其对DDP的敏感性，可能与其诱导凋亡及降低耐药基因的表达有关。

关键词〔〕miR-34a；非小细胞肺癌；顺铂；耐药性

1南京医科大学附属南京市妇幼保健院医学研究中心

第一作者：刘明明(1984-)，女，药师，主要从事药物分析等药学方面的研究。

由于肺癌症状不明显，发病较为隐匿，多数确诊时已为晚期，故系统化疗仍为主要治疗手段，但目前较为常见的化疗耐药限制了其效果，寻找逆转化疗耐药的潜在策略已成为肺癌防治的热点〔1～3〕。多项研究指出miRNA表达异常介导了肿瘤化疗耐药过程，提示筛选在化疗耐药过程中异常表达的miRNA可能有一定参考价值〔4,5〕。miR-34a在多种肿瘤组织中低表达，且参与了多种肿瘤的化疗耐药〔6，7〕，但目前其在肺癌化疗耐药中的作用尚不清楚。本研究选用A549细胞的顺铂(DDP)耐药肺腺癌细胞系株A549/DDP进行相关实验，通过目前常用的真核过表达体系pCDNA3.1+miR-34a上调其表达，进一步观察对其DDP敏感性的影响。

1资料与方法

1.1主要试剂A549及A549/DDP细胞购自中国医学科学院上海细胞库，RPMI1640培养液、胎牛血清及RNA快速抽提纯化(Trizol)试剂盒购自美国GIBCO公司，脂质体Lipofectamine 2000TM购自美国Invitrogen公司，CCK-8试剂盒购自日本同仁公司，Power SYBR Green PCR Master Min购于美国LifeTechnologies公司，miR-34a引物及过表达miR-34a的真核重组质粒pCDNA3.1+miR-34a由上海生工生物工程技术服务有限公司构建，小鼠抗人肺耐药相关蛋白(LRP)单克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，山羊抗人P-糖蛋白(P-gp)单克隆抗体、多药耐药相关蛋白(MRP)1单克隆抗体均购自英国Abcam公司，抗山羊和抗小鼠辣根过氧化物酶耦联的二抗购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.2细胞培养将冻存于液氮中的细胞复苏后采用RPMI 1640培养液进行常规条件培养(温度保持在37℃、CO2浓度为5%及100%湿度)，A549、A549/DDP细胞均用含10%灭活胎牛血清、100 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素的RPMI1640培养液培养。此外，用于A549/DDP细胞培养的RPMI 1640培养液中添加DDP并调整终浓度至1 μg/ml。待以上两种细胞达对数生长时，进行传代及后续实验。根据实验设计将对数生长的A549/DDP细胞分为对照组、空转染组和过表达组，对照组不行转染处理，过表达组通过脂质体 lipofectamine 2000将pCDNA3.1+miR-34a过表达载体转染至A549/DDP细胞，空转染组则转染空质粒；分别于转染24、48、72和96 h后提取各组RNA，采用实时荧光定量PCR(qPCR)法检测各组miR-34a水平。

1.3qPCR检测收集各组转染后不同时间点的细胞，采用Trizol提取总RNA，并按照试剂盒说明书依次进行cDNA合成及qPCR反应。(1)cDNA合成的逆转录体系体积为20 μl：总RNA 1 μg、5×逆转录反应缓冲液4 μl、M-MLV逆转录酶200 U、随机引物200 ng、10 mmol/L dNTP 1 μl及RNasin 20 U，采用ddH2O 补齐至20 μl。反应条件：42℃ 60 min；70℃ 10 min。(2)取5.0 μl cDNA进行PCR扩增反应，反应条件为95 ℃ 预变性30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。采用U6作为内参。采用Ct值法(2-△△CT)进行相对定量分析。

1.4CCK-8法(1)采用CCK-8试剂盒检测转染pCDNA3.1+miR-34a对A549/DDP细胞增殖的影响，分别于转染24、48、72、96 h后，经0.25%胰酶消化并制备单细胞悬液，每孔加入10 μl CCK-8试剂，培养箱继续孵育4 h后，采用酶标仪比色法检测各组细胞在450 nm波长下的吸光值(A)，根据公式计算增殖抑制率：抑制率=(1-A其余处理组)/A对照组×100%。(2)采用CCK-8试剂盒检测A549/DDP细胞对DDP敏感性变化，向单细胞悬液加入浓度梯度的DDP(2、4、8、16、32和64 μg/ml)，转染48 h后加入CCK-8并检测A，根据增殖抑制率公式计算DDP的半数抑制浓度(IC50)。每组设5个平行孔。

1.6流式细胞术采用RPMI1640培养液将A549/DDP细胞调整至1×105个/ml，接种于96孔培养板中，分别于转染48、96 h后收集各组细胞，采用75%冷乙醇于4℃固定过夜后，加入终浓度200 μg/ml RNase A，向各组细胞中加入Annexin V/FITC和PI进行双标染色，染色15 min后采用FAC SAria流式细胞仪测定早、晚期凋亡率。

1.7Western印迹转染48 h后收集各组细胞 5×106个，采用RIPA细胞裂解液裂解A549/DDP细胞，提取总蛋白并采用Lowry法检测蛋白浓度。每孔取40 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白分离后采用半干转法将蛋白印迹转移至PVDF膜上(孔径为0.45 μm)，经5%脱脂牛奶室温封闭1 h后，分别加入P-gp、MRP1及LRP的一抗，覆盖PVDF膜后4℃冰箱过夜，稀释度依次为1∶200、1∶300和1∶200，TBST缓冲液洗膜3次，加二抗(1∶3 000稀释)，37℃孵育1 h，TBST洗膜后采用ECL发光试剂盒发光，曝光、显影、定影后进行目的条带光密度分析，最终结果为目的条带光密度与内参GAPDH的比值。

1.8统计学分析采用SPSS15.0软件进行单因素方差分析及LSD-t检验。

2结果

2.1A549/DDP细胞的miR-34a水平A549/DDP细胞的miR-34a水平(0.45±0.06)低于其亲本细胞A549(0.75±0.11)和正常支气管上皮细胞系HBE(1.03±0.09)，且A549的miR-34a水平亦低于HBE(P<0.05)。转染24、48、72及96 h后，过表达组的miR-34a水平均高于对照组和空转染组(P<0.05)，转染96 h后过表达组的miR-34a水平分别升高至对照组的(6.21±0.74)倍和空转染组的(6.34±0.90)倍，且对照组和空转染组不同转染时间点miR-34a水平无统计学差异(P>0.05)，见图1。

图1　转染后A549/DDP细胞的miR-34a水平变化

2.2过表达miR-34a对A549/DDP细胞增殖的影响与其余两组比较，过表达组的增殖抑制率升高(P<0.05)，且对照组和空转染组各时间点均无统计学差异(P>0.05)；过表达组中随着转染时间的延长，增殖抑制率升高，且转染96 h后的增殖抑制率为(55.69±4.05)%，均高于其余时间点(P<0.05)。见表1。

表1　过表达miR-34a对A549/DDP细胞增殖率的影响

与空转染组比较：1)P<0.05

2.3过表达miR-34a对A549/DDP细胞DDP耐药的影响转染48 h后，对照组、空转染组和过表达组的IC50值依次为(36.02±2.93)、(34.66±2.70)和(14.52±1.78)μg/ml，过表达组的IC50值均低于其余两组(P<0.05)，且对照组和空转染组无统计学差异(P>0.05)。

2.4过表达miR-34a对A549/DDP细胞凋亡的影响过表达组转染48、96 h后的凋亡率均高于对照组和空转染组，且过表达96 h后的早、晚期凋亡率高于48 h(P<0.05)；对照组和空转染组转染48、96 h后凋亡率无统计学差异(P>0.05)，见表2。

表2　过表达miR-34a对A549/DDP细胞凋亡率的

对照组比较：1)P<0.05；与空转染组比较：2)P<0.05；与48 h比较：3)P<0.05

2.5过表达miR-34a对A549/DDP细胞耐药相关蛋白的影响过表达组转染48 h后的P-gp、MRP1及LRP蛋白水平均低于对照组和空转染组(P<0.05)；对照组和空转染组耐药相关蛋白无统计学差异(P>0.05)，见表3，图2。

表3　过表达miR-34a对A549/DDP细胞耐药相关蛋白的

与对照组比较：1)P<0.05；与空转染组比较：2)P<0.05

图2　过表达miR-34a对A549/DDP细胞耐药相关蛋白的影响

3讨论

近期研究发现miR-34a介导了多种肿瘤的耐药，通过外源模拟物或质粒载体上调其水平可起到逆转耐药或重建对化疗药物敏感性的效果〔8，9〕，提示上调miR-34a水平可能为一种潜在的逆转策略。何静等〔8〕发现miR-34a在乳腺癌细胞株MCF-7和耐药株MCF7/ADR中存在表达差异，而在耐药细胞株中呈下调趋势，本研究亦发现A549/DDP中的miR-34a水平低于其亲本A549，与何静等〔8〕的结果一致，表明miR-34a参与了多种肿瘤的化疗耐药过程。此外，miR-34a在胰腺癌细胞获得性耐药中发挥一定作用，如刘林〔7〕发现miR-34a表达减少参与了胰腺癌细胞株SW1990细胞对5氟尿嘧啶获得性耐药。以上结果进一步提示miR-34a表达减少在肿瘤化疗耐药中发挥正向促进作用。通过转染过表达miR-34a的质粒载体或其模拟物miR-34a mimics可增强某些肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，如MCF-7/ADR对于多柔比星的敏感性〔8〕和SW1990细胞对5氟尿嘧啶的敏感性〔9〕。同时，miR-34重建对p53缺陷肿瘤的化疗耐药性亦有一定逆转效果〔10〕。

本研究发现，在转染24 h后即可发现miR-34a水平升高，且上调效果可持续至96 h，表明载体构建较为成功，而空转染组miR-34a水平与对照组无统计学差异，说明该载体安全可靠，避免了对研究的影响。将转染成功的A549/DDP细胞暴露在浓度梯度的DDP中发现，过表达后的细胞对DDP的敏感性增强，主要表现在DDP对A549/DDP细胞的IC50降低，证实过表达miR-34a有助于逆转肺癌细胞的化疗耐药，验证了本研究之前的假设，与相关报道的结论〔9，10〕一致。此外，本研究亦发现过表达miR-34a A549/DDP细胞的增殖抑制率升高，提示过表达miR-34a可影响肿瘤细胞的增殖，并且过表达组细胞出现细胞体积变小、核固缩等凋亡表现。流式细胞仪检测结果提示miR-34a本身具有抑癌基因的效果，总体上miR-34a增加A549/DDP细胞对DDP的敏感性，有逆转耐药的潜能。

多项研究指出逆转耐药的潜在策略同样可影响耐药蛋白的相关表达〔11〕。本研究发现过表达miR-34a后，3种在肺癌中常见的耐药蛋白(LRP、P-gp和MRP1)水平均降低，且MRP1的降低幅度最大，推测可能为miR-34a发挥逆转潜在的途径。此外，有研究发现miR-34a还可通过多种途径逆转耐药，如Wu等〔12〕发现miR-34a可通过靶向 HDAC1和 HDAC7 来调控乳腺癌化疗中的耐药过程。综上所述，A549/DDP细胞中miR-34a水平较低，通过真核载体将其过表达后可提高其对DDP的敏感性从而达到逆转耐药的效果，可能与其抑制增殖、诱导凋亡及降低耐药基因的表达有关，上调miR-34a可能在逆转肺癌细胞化疗耐药中有一定价值。

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〔2015-04-19修回〕

(编辑徐杰)

中图分类号〔〕R735〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2016)01-0052-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.023