大电导钙激活钾通道介导血管平滑肌细胞增殖及其机制

杨国勋　李　志　刘唐威　李健玲　史吉莹　钱　静

(广西医科大学第一附属医院心血管病研究所，广西　南宁　530021)



大电导钙激活钾通道介导血管平滑肌细胞增殖及其机制

杨国勋李志刘唐威李健玲史吉莹钱静

(广西医科大学第一附属医院心血管病研究所，广西南宁530021)

摘要〔〕目的探讨大电导钙激活钾通道(BKca)是否通过Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号途径影响兔主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖。方法用低浓度的四乙胺(TEA)处理体外传代培养的家兔胸主动脉VSMC。采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)和流式细胞术(FCM)检测TEA对VSMC的增殖和细胞周期的影响，分别采用免疫组化法和免疫印迹法检测增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(P-ERK1/2)蛋白表达。结果(1)MTT法检测结果显示，TEA能够呈时间依赖性和剂量依赖性地降低吸光值、增加细胞抑制率(P<0.05)；(2)流式细胞术分选结果显示，TEA处理48 h后能够呈剂量依赖性地增加G1期细胞比例，减少S期、G2期细胞比例(P<0.05)；(3)免疫组化检测结果显示，随着TEA浓度的增加，VSMC的PCNA阳性表达率逐渐下降(P<0.01)；(4)免疫印迹法结果表明，经400 μmol/L的TEA处理48 h后，ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表达，ERK活化率与未经处理的对照组比较，均无统计学意义(t=0.354～1.035,P>0.05)。结论TEA可呈浓度依赖性地阻止细胞周期由G1向S期推进，抑制VSMC增殖；该过程的分子机制不经由Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号途径介导。

关键词〔〕血管平滑肌细胞；大电导钙激活钾通道；四乙胺；增殖

第一作者：杨国勋(1968-)，男，硕士，硕士生导师，副主任医师，主要从事高血压、冠心病基础与临床研究。

诱导血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡、抑制VSMC增殖是防治心血管疾病发生的理想靶点〔1，2〕。大电导钙激活钾通道(BKca)是VSMC上处于优势地位的离子通道，对于血管平滑肌的功能具有调节作用〔3〕。近来研究表明，BKca还介导VSMC的增殖过程，但具体的信号转导机制尚未完全阐明，可能与细胞外信号调节激酶(ERK)信号转导途径有关〔4〕。本研究拟观察体外传代培养的兔胸主动脉VSMC中加入低浓度的四乙胺(TEA)阻断BKCa后对VSMC增殖的影响以及ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表达的变化。

1材料与方法

1.1材料健康一级清洁家兔，体重2.5～3 kg，3～4月龄，雌雄不拘，购自广西医科大学动物实验中心。TEA、噻唑盐(MTT)为Sigma公司；胎牛血清为HyClone公司；α-actin单克隆抗体为武汉博士德公司；增殖细胞核抗原(PCNA)抗体为博奥森公司；免疫组化试剂盒为北京中杉金桥公司；细胞周期试剂盒为美国BD公司；抗ERK1/2单克隆抗体，抗磷酸化ERK单克隆抗体为R&D公司；α-actin内参抗体为Earthox公司。

1.2VSMC的分离、培养和鉴定采用贴壁培养法培养VSMC的原代细胞，在无菌条件下分离出胸主动脉，去除内、外膜，将中膜撕成2 mm左右的条状。将其与0.2%的胶原酶Ⅰ20 ml一同放入50 ml的培养瓶中，置入37℃培养箱中培养，血管松散后用吸管吹打制成含单个细胞的悬液，过滤、离心后用含20%胎牛血清的DMEM液制成细胞悬液置入培养瓶中，放入37℃、5%CO2的培养箱中培养。用0.25%胰酶消化传代，实验选用2～3代的VSMC细胞，经光学显微镜和α-actin免疫组化技术进行鉴定。

1.3实验分组及处理实验分为对照组、低浓度组、中浓度组、高浓度组，分别用浓度为0、100、200、400 μmol/L TEA的10%胎牛血清培养液处理24、48、72 h。

1.4四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)测细胞活性将生长良好的2～3代VSMC单细胞悬液接种于96孔板，密度为2×104个细胞/孔，培养48 h后，用无血清DMEM培养基继续培养24 h，实验组加入不同浓度TEA，置入37℃孵箱培养分别培养24、48、72 h，加入MTT继续孵育5 h，弃掉培养液，每孔加入150 μl的二甲基亚砜(DMSO),采用酶联免疫检测仪测定各孔吸光值，每组设5个复孔，实验重复3次。在酶标测仪上读取490 nm处的吸光值(A值)，并计算细胞抑制率，细胞抑制率=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%

1.5流式细胞术检测VSMC周期将1×106个/ml经不同浓度TEA血清培养制成的单细胞悬液，接种于6孔板上，置入培养箱培养48 h，去培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，0.125%胰酶消化，吹打成单细胞悬液，1 000 r/min离心10 min弃上清液，再加入1 ml PBS吹打，再离心1次。向收集细胞中加入4℃70%乙醇混匀，固定后PBS清洗，调整细胞密度为106个/ml，4℃加入1 ml碘化丙啶(PI)避光染色25 min，500目铜网过滤，检测，实验重复3次。

1.6免疫组化测PCNA细胞消化后，采用不同TEA浓度血清培养基制成密度为(1～5)×104/L细胞悬液，分别滴于24孔板圆片上，每组6孔，置入37℃、5%CO2培养箱中培养48 h，取出孔板按下列步骤进行：PBS漂洗，4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X100室温处理、3%H2O2处理，滴加一抗，试剂孵育(以上每步后均PBS漂洗3次×2 min)，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染10 s，脱水、透明、封片，显微镜下随机计数200个细胞，计算阳性细胞百分比，实验重复3次。

1.7ERK1/2、P-ERK1/2蛋白含量的检测采用免疫印迹法，将105～106个/ml经不含乙二胺四乙酸(EDTA)消化酶消化的2～3代细胞，接种于6孔板中，置于培养箱培养24 h，吸尽孔内液体，加入无血清培养基培养24 h，对照组不加TEA，实验组加400 μmol/L TEA胎牛血清培养液，培养48 h吸净培养基，PBS冲洗3次，加入细胞裂解液500 μl，充分裂解30 min，将细胞碎片与裂解液移至1.5 ml EP管中，1 200 r/min离心10 min，取上清液测定蛋白含量,蛋白变性，十二烷硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，转膜后封闭，依次加入一抗、二抗进行抗原抗体免疫反应，经化学发光、显影、定影后应用凝胶图像分析系统进行分析，蛋白水平以目标蛋白与α-actin的比值(A%)来表示。

1.8统计学方法采用SPSS18.0统计学软件进行t检验、方差分析。

2结果

2.1培养的兔胸主动脉VSMC形态与免疫组化鉴定显微镜下VSMC呈梭形形状，有典型的谷峰样生长；免疫细胞化学染色α-actin呈阳性，证实VSMC培养成功。见图1。

图1　兔血管平滑肌细胞的鉴定

2.2TEA作用后VSMC抑制率方差分析显示：同一时间点不同TEA剂量间比较，TEA能够呈剂量依赖性地增加细胞抑制率，同一TEA浓度不同时间点间比较，TEA能够呈时间依赖性地增加细胞抑制率，均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3TEA作用后对VSMC细胞周期的影响方差分析显示：TEA能够呈剂量依赖性地增加G1期细胞比例，减少S期、G2期细胞比例(P<0.05)。见表2。

表1　各组细胞间的细胞抑制率比较

与低浓度组比较:1)P<0.05；与中浓度组比较:2)P<0.05；与24 h比较:3)P<0.05；与48 h比较：4)P<0.05

表2　各组细胞间的细胞周期比例比较±s，n=3)

与对照组比较:1)P<0.05；与低浓度组比较:2)P<0.05；与中浓度组比较:3)P<0.05

2.4免疫组化检测PCNA表达对照组、低浓度组、中浓度、高浓度组PCNA阳性表达率分别为(49.67±3.51)%、(41.25±2.65)%、(32.67±2.08 )%、(22.33±2.52)%，各组比较均有显著性差异(P<0.01)。可见随着TEA浓度的增加，VSMC的PCNA阳性表达率逐渐下降。见图2。

图2　PCNA蛋白在VSMC的表达(免疫组化)

2.5免疫印迹法测定ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表达VSMC中ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表达在对照组和实验组(高浓度组)差异均无统计学意义(P>0.05)，ERK活化率(P-ERK1/2蛋白占ERK1/2蛋白表达的百分率)在两组间比较差异亦无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3　血管平滑ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白表达

图3　ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表达

3讨论

VSMC的增殖与异常活动在动脉粥样硬化等血管增殖性心血管疾病的发生发展中起重要作用。BKca是在VSMC中表达丰富的离子通道，具有调节激素和神经递质释放、调节血管张力等多种生理功能〔5〕，并介导了VSMC的增殖〔4〕。企图通过调节BKca来影响VSMC的增殖是防治心血管疾病的重要策略之一。Ivanov等〔6〕报道，在大鼠小脑延髓池中注入表皮生长因子(EGF)，能上调血管平滑肌PCNA的表达，并被BKca特异阻断剂iberiotoxin所阻断，提示BKca通道介导了EGF引起的VSMC的增殖。TEA亦是BKca的阻断剂，能够阻断BKCa的开放。文献报道〔7〕，高浓度TEA对钾离子通道(Kca)类型的阻滞作用没有特异性，而低浓度TEA对Kca通道才有特异的阻断作用。TEA对于BKca通道的半数抑制浓度为200 μmol/L〔8〕。因此，本实验选择低浓度TEA 来阻断BKca通道。

在TEA对VSMC增殖影响的研究中，钱济先等〔9〕报道，采用Kca的阻断剂TEA可以使体外培养的兔股静脉VMSC增殖。但对于体外培养的人体支气管MSC，应用TEA阻断Kca则对平滑肌细胞(MSC)的增殖和凋亡没有明显的作用〔10〕。本研究结果表明TEA可以阻止VSMC由G0/G1向S期推进。同时，TEA亦呈浓度依赖性地提高VSMC的细胞抑制率，下调PCNA的表达，抑制了VSMC的增殖。与钱济先等〔9〕的报道不一致。可能是由于使用了不同的TEA浓度所致。这也被肖娟等〔11〕应用BKCa的特异性阻断剂Iberiotoxin(IBTX) 抑制VSMC的增殖所证实。

VSMC增殖的有关信号转导途径仍在不断研究中。Liu等〔12〕报道，高盐通过ERK1/2依赖途径提高血管紧张素Ⅱ诱导的VSMC增殖；蜂毒明肽抑制重组人血小板衍生生长因子-BB( PDGF-BB)诱导VSMC迁延与增殖亦通过抑制Akt和Erk信号途径的活化〔13〕。但BKca离子通道与ERK1/2信号途径的关系研究不多。Si等〔14〕报道，在体外培养的A7r5VSMC中，在促有丝分裂剂PDGF刺激后BKca/rKca1.1表达和功能的下调不需要ERK1/2的磷酸化；Fernández-Marino等〔4〕则发现，钨酸盐通过促进ERK1/2磷酸化，减少PDGF诱导VSMC的增殖，当用IBTX阻断BKca后，则抑制了这种作用。而单独使用IBTX时对PDGF诱导的VSMC的增殖没有显著的影响。本研究提示TEA抑制VSMC增殖、阻滞细胞周期由G0/G1向S期推进不经由Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号途径介导。

综上所述，离子通道BKca和Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号途径均与VSMC的增殖有关，但在不同的病理生理条件下，它们相互间的作用关系不同，深入探讨这些作用靶点及其关系对于抑制VSMC增殖达到防治心血管疾病有着重要的意义，BKca是否通过其他信号途径影响VSMC增殖还有待研究。

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〔2015-05-21修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

基金项目：广西自然科学基金 (No.2010GXNSFA013175)

中图分类号〔〕R39〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2016)01-0016-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.007