蜂花粉可溶性膳食纤维酶法提取工艺优化及其理化分析

郑 慧 陈希平 尤祯丹 夏冬雪 胡 熙

(湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208)

蜂花粉可溶性膳食纤维酶法提取工艺优化及其理化分析

郑 慧 陈希平 尤祯丹 夏冬雪 胡 熙

(湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208)

采用纤维素酶法提取蜂花粉可溶性膳食纤维，分析其理化特性，并与酸提、碱提产品进行对比。结果表明，酶法提取蜂花粉可溶性膳食纤维最优工艺条件为：酶解温度50 ℃，酶解时间2 h，酶用量2.5%，pH 4。在该条件下，可溶性膳食纤维得率为4.11%，产品呈乳白色、粉体，荷花蜂花粉特有气味浓郁，膨胀力2.03 mL/g、持水力1.01 g/g、水溶性91.26%，含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖7种单糖组分，具有多糖特征吸收峰。与碱提、酸提工艺相比, 酶提产品具有较好水溶性和感官品质，更易于应用在饮料类食品的开发中。

蜂花粉；可溶性膳食纤维；酶法提取；单糖组分；红外光谱

蜜蜂花粉，简称蜂花粉，是蜜蜂从显花植物花药内采集的花粉粒，向其内加入了花蜜与唾液，混合而成的一种不规则扁圆形团状物[1]。蜂花粉营养丰富[2-3]，具有多种保健功能[4-6]，被誉为“微型营养库”。但由于蜂花粉含砂含杂、口感独特，且细胞壁质地坚硬、生物利用率差，目前大部分蜂花粉被直接作为蜂粮用于饲养蜜蜂，深加工产品较少。中国作为世界第一养蜂大国，其资源优势远未体现[7]。近年来蜂花粉研究主要集中在细胞壁的破壁工艺[8-9]，以及其生物类黄酮、多糖的提取和研究上[4,10-11]，对于纤维类成分仅在营养组分测定中有所提及，并未有系统深入地研究。

可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber，SDF)是指不被人体消化道酶消化，能溶于温热水，和水结合形成凝胶物质，且其水溶液能被4倍体积的乙醇再沉淀的那部分物质。其主要通过在大肠中发挥代谢作用达到降低胆固醇、防治高血压及心血管疾病等多种功效[12-13]。同时良好的水溶性，使其能更广泛地应用在各类食品中，尤其是饮料类产品的开发中[14]。SDF常规提取方法有碱提、酸提和酶提[15]。本试验拟采用纤维素酶法提取蜂花粉SDF，并与前期研究得到的酸提[16]、碱提[17]产品进行对比，比较不同提取方法对蜂花粉SDF产品特性的影响，旨在为蜂花粉SDF进一步的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与主要仪器

1.1.1 材料与试剂

荷花蜂花粉：市售；

纤维素酶、三氟乙酸、1-苯基-3-甲基-5-吡啶酮(PMP)：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

单糖标准品(葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸)：色谱纯，上海叶源生物科技有限公司；

乙腈、甲醇：色谱纯，默克化工技术(上海)有限公司；

其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

恒温振荡器：ZHWY-200D型，上海智诚分析仪器制造有限公司；

电子分析天平：AV1120型，日本岛津仪器有限公司；

实验室pH计：STARTER3100/F型，奥豪斯仪器有限公司；

傅立叶变换红外光谱仪：Nicolet iS5型，赛默飞世尔科技公司；

高效液相色谱仪(配紫外检测器)：Agilent 1260型，美国安捷伦公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蜂花粉SDF酶提工艺 蜂花粉经日光晒干、除杂、粉碎过30目筛，备用。将预处理后的蜂花粉按1∶15(g/mL)料液比溶于一定pH水溶液中，加入一定量的纤维素酶，搅拌均匀，置于恒温培养振荡器中于一定温度下以250 r/min振摇酶解一定时间。酶解后85 ℃水浴10 min灭酶活，3 500 r/min 离心10 min[14]取上清液，加入4倍体积预热至60 ℃ 95%乙醇，静置1 h，絮状沉淀析出，3 500 r/min离心10 min取沉淀，真空干燥至恒重得到酶提蜂花粉SDF。

1.2.2 单因素试验

(1) 酶解时间对SDF得率的影响：固定反应条件为酶解温度40 ℃、pH 4、酶用量1.5%，考察不同的酶解时间(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h)对蜂花粉SDF得率的影响。

(2) 酶用量对SDF得率的影响：固定反应条件为酶解温度40 ℃、pH 4、酶解时间1.5 h，考察不同的酶用量(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%)对蜂花粉SDF得率的影响。

(3) 酶解温度对SDF得率的影响：固定反应条件为酶用量2.0%、pH 4、酶解时间1.5 h，考察不同的酶解温度(40，45，50，55，60 ℃)对蜂花粉SDF得率的影响。

(4) pH对SDF得率的影响：固定反应条件为酶用量2.0%、酶解温度50 ℃、酶解时间1.5 h，考察不同的pH(2，3，4，5，6)对蜂花粉SDF得率的影响。

蜂花粉SDF得率按式(1)计算：

(1)

式中：

x——蜂花粉SDF得率，%；

M0——初始蜂花粉质量，g；

M1——提取后干燥至恒重的蜂花粉SDF质量，g。

1.2.3 正交试验设计 在单因素试验的基础上，设计L9(34)正交试验，以蜂花粉SDF得率为考察指标。

1.2.4 蜂花粉SDF感官品质 从成品色泽、气味、性状初步比较酶提、酸提、碱提工艺制备的蜂花粉SDF感官品质。

1.2.5 蜂花粉SDF膨胀力、持水力和水溶性的测定

(1) 膨胀力的测定：根据文献[18]。

(2) 持水力的测定：根据文献[19]，修改如下：准确称取0.500 g蜂花粉SDF于100 mL三角烧瓶中，加入40 mL蒸馏水，置于恒温震荡器中30 ℃、250 r/min震荡2 h，4 000 r/min 离心15 min，除去上清液称重，并按式(2)计算：

(2)

式中：

c——蜂花粉持水力，g/g；

m0——初始蜂花粉质量，g；

m1——除去上清液后蜂花粉质量，g。

(3) 水溶性的测定：根据文献[17]。

1.2.6 蜂花粉SDF单糖组分测定 采用柱前衍生化HPLC法测定。

(1) 蜂花粉SDF酸水解及衍生化产物的制备：根据文献[20]。

(2) 色谱条件：Ultimate XB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相 乙腈—0.05 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 6.9)(体积比17∶83)；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；检测波长250 nm；进样量10 μL。

1.2.7 红外光谱测定 用傅立叶变换红外光谱仪进行测定，波数范围400～4 000 cm-1。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶解时间对蜂花粉SDF得率的影响 由图1可知，在试验范围内，随着酶解时间的增加，蜂花粉SDF得率先升高再降低后略有增加，在1.5 h时蜂花粉SDF得率最高。这可能是酶解初期随着酶解时间增加，原料与酶接触更加充分，酶解后形成一定聚合度、高分子质量的蜂花粉SDF，能被95%的乙醇有效沉淀，使得蜂花粉SDF得率增加；此后，随着酶解时间增加，这类具有一定聚合度的高分子质量的蜂花粉SDF被过度水解，生成低聚合度的不易被95%乙醇沉淀的组分，不能被离心收集[21]，从而使蜂花粉SDF得率下降。因此选择酶解时间为1.5 h为宜。

2.1.2 酶用量对蜂花粉SDF得率的影响 由图2可知，在试验范围内，随着酶用量的增加，蜂花粉SDF得率逐步增加后趋于平稳。可能是初期随纤维素酶用量增加，蜂花粉酶解愈加充分，得率增加；而酶用量增加至2.0%后，相对于蜂花粉质量，酶用量逐渐趋于饱和，得率也趋于平稳。因此从生产成本考虑，选择酶用量为原料的2.0%为宜。

图1 酶解时间对蜂花粉SDF得率的影响

图2 酶用量对蜂花粉SDF得率的影响

2.1.3 酶解温度对蜂花粉SDF得率的影响 由图3可知，在试验范围内，随着酶解温度升高蜂花粉SDF得率先升高后降低。这是因为酶解温度过高或过低都会影响纤维素酶的活性，使得蜂花粉酶解不充分，不能被95%乙醇有效沉淀，使得蜂花粉SDF得率偏低。因此选择酶解温度50 ℃为宜。

2.1.4 pH对蜂花粉SDF得率的影响 由图4可知，在试验范围内，蜂花粉SDF得率先升高后降低。因为只有在酶的最适pH范围内，酶才具有较好的催化活性。而当反应条件远离最适pH范围，酶的活性降低，酶解不充分，从而使蜂花粉SDF得率降低。因此选择pH 4为宜。

图3 酶解温度对蜂花粉SDF得率的影响

图4 pH对蜂花粉SDF得率的影响

2.2 正交试验结果及数据分析

正交试验因素水平取值见表1。

表1 正交试验因素水平表

由表2可知，4个因素对蜂花粉SDF得率影响大小为B>A>C>D；最佳提取工艺条件为A2B3C3D2，即酶解温度50 ℃，酶解时间2 h，酶用量2.5%，pH值4。由于此组合在正交表中并未列入，按此条件进行验证实验，蜂花粉SDF得率为(4.11 ± 0.04)%，高于正交表中的试验值。

表2 正交试验结果

2.3 不同提取方式蜂花粉SDF感官品质、膨胀力、持水力和水溶性

与蜂花粉SDF的酸提工艺[16](得率7.31%)、碱提工艺[17](得率12.51%)相比，酶提工艺得率较低。3种提取方式制备的蜂花粉SDF产品，其感官指标、膨胀力、持水力、水溶性见表3。在感官品质上，与酸提、碱提产品比较，酶提产品呈乳白色、颜色较浅，后期应用对成品色泽影响较小；荷花蜂花粉特有香味浓郁；呈粉末状，易粉碎及后续处理。故在感官品质上酶提产品可开发性较好。

与酸提、碱提产品比较，酶提产品的膨胀力介于二者之间，持水力最低，一方面可能因为不同的提取方式制备的蜂花粉SDF其组分不同；另一方面较好的水溶性会使酶提产品或多或少地溶入水中，从而影响其膨胀力和持水力的测定。酶提蜂花粉SDF水溶性高达91.26%，是酸提产品的1.07倍、碱提产品的1.51倍。故与酸提、碱提产品相比，酶提产品感官品质较好，水溶性较高，更易于应用在饮料类功能产品的研发中。

表3 蜂花粉SDF感官品质、膨胀力、持水力和水溶性†

† 同一列中标不同字母表示差异极显著(P<0.05)。

2.4 不同提取方式蜂花粉SDF单糖组分

混合标准单糖和酶提产品液相色谱图见图5，酶提、酸提、碱提3种方式制备的蜂花粉SDF单糖组分相对质量见表4。由表4可知，3种提取方式制备的蜂花粉SDF产品均含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖5种单糖组分，此外酶提产品还含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸2种糖醛酸组分。结果表明，蜂花粉SDF提取方式不同，得到SDF产品单糖组分及其相对含量有所差异，这可能是不同提取条件，蜂花粉细胞壁裂解的组分不同、同一组分裂解方式不同。

2.5 不同提取方式蜂花粉SDF红外光谱图

酶提、酸提、碱提蜂花粉SDF红外光谱见图6，不同提取方式制备的蜂花粉SDF红外光谱图均具有多糖特征吸收峰，且峰形相似，但吸收峰的相对强度各有差异。其中，在3 304 cm-1附近吸收峰，为O—H伸缩振动；2 927 cm-1附近吸收峰，为糖类的C—H伸缩振动；1 637 cm-1附近吸收峰，为C═O伸缩振动；1 410 cm-1附近吸收峰，为C—H变角振动；1 070 cm-1附近吸收峰，为C—O伸缩振动，也属于糖分子的特征峰[22]。另一方面，不同提取条件下产品组分、纯度略有差异，可能导致吸收峰强度不同[23]。

1. 甘露糖 2. 鼠李糖 3. 葡萄糖醛酸 4. 半乳糖醛酸 5. 葡萄糖 6. 半乳糖 7. 阿拉伯糖

图5 混合标准单糖、酶提蜂花粉SDF的液相色谱图

Figure 5 HPLC chromatogram of standard mixed monosaccharides and bee pollen SDF in enzymatic extraction

表4 蜂花粉SDF单糖组分相对含量

a. 碱提 b. 酶提 c. 酸提

3 结论

用纤维素酶提取蜂花粉SDF，酶提产品呈乳白色粉状，具有荷花蜂花粉特有香味，具有一定的膨胀力、持水力，水溶性较好，含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖7种单糖，其红外光谱图具有多糖的特征吸收峰。

蜂花粉SDF酸提、碱提、酶提3种提取工艺中，碱提工艺得率最高；酶提产品感官品质、水溶性较好，利于后期的加工处理，更易于应用在功能食品，尤其是饮料类产品的开发中。

后期将对3种提取工艺制备的SDF进行分离纯化及功能特性比较，为产品开发利用提供进一步的理论依据。

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Enzymatic extraction of bee pollen soluble dietary fiber and its physicochemical analysis

ZHENG HuiCHENXi-pingYOUZhen-danXIADong-xueHUXi

(CollegeofPharmacy,HunanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Changsha,Hunan410208,China)

Bee pollen soluble dietary fiber was extracted by enzymatic extraction, and the physicochemical properties was analyzed, while, the products were compared with the bee pollen soluble dietary fiber by acid extraction and alkali extraction. The optimal enzymatic extraction conditions were determined as follows: extraction temperature 50 ℃, extraction time 2 h, enzyme 2.5%, pH 4. Under the conditions, the yield of bee pollen soluble dietary fiber was 4.11%. The product is milk-white powder, and has good smell. The swelling capacity, water holding capacity and the water-solubility of the fiber were 2.03 mL/g, 1.01 g/g, 91.26%, respectively. The bee pollen soluble dietary fiber was composed of 7 kinds of monosaccharide, such as mannose, rhamnose, glucuronic acid, galacturonic acid, glucose, galactose and arabinose, and has the absorption peak of polysaccharides. Compared with alkali extraction and acid extraction, The bee pollen soluble dietary fiber has better water solubility and sensory quality, and is easier to apply enzymatic extraction to the beverage products development.

bee pollen; soluble dietary fiber; enzymatic extraction; monosaccharides; infrared spectrum

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.040

湖南省科技厅科技计划项目(编号：2014SK3015)；湖南中医药大学青年教师科研基金(编号：99820001-131)

郑慧，女，湖南中医药大学讲师，硕士。

陈希平(1964-)，女，湖南中医药大学副教授，博士。 E-mail: 1716425066@qq.com

2016—09—05