复合菌固态发酵猪骨素产谷氨酸培养基优化

王新惠,张 超,朱文优,肖龙泉,李 婧,黄艳淋

(1.成都大学药学与生物工程学院,四川成都 610106;2.宜宾学院发酵资源与应用四川省高校重点实验室,四川宜宾 644000)

复合菌固态发酵猪骨素产谷氨酸培养基优化

王新惠1,张 超2,朱文优2,肖龙泉1,李 婧1,黄艳淋1

(1.成都大学药学与生物工程学院,四川成都 610106;2.宜宾学院发酵资源与应用四川省高校重点实验室,四川宜宾 644000)

优化米曲霉-红曲霉复合菌固态发酵猪骨素产谷氨酸的固态培养基以提高谷氨酸产量。通过单因素实验和正交实验,以谷氨酸产量为指标,研究培养基中碳源、氮源和表面活性剂对谷氨酸产量的影响并对其进行优化。结果表明,复合菌固态发酵的最佳固态培养基组分为麸皮100 g,猪骨素600 g,硫酸铵15 g,三聚甘油单硬脂酸酯3 g,补水至1000 g。在此条件下,30 ℃发酵5 d,谷氨酸产量达到167.8 g/kg,总氨基酸产量达到728.6 g/kg。

米曲霉,红曲霉,猪骨素,谷氨酸

我国是产肉大国,四川是肉类生产大省,年出栏生猪8000多万头,约占全国70%[1]。据统计,每年屠宰加工过程中产生大量的肉类副产物,其中鲜骨可达2000万吨以上,由于缺乏相应的处理技术,其精深加工率不足10%[2]。如何高效利用屠宰分割副产物-猪骨,已经成为肉类加工业亟待解决的首要问题。近年来,提取骨中蛋白质、氨基酸等营养物质,提升肉类加工副产品的附加值已成为研究热点之一。

猪骨素是以天然猪骨抽提物为原料制备的膏状物,呈浅褐色或褐色,有较强的腥味,其主要成分为胶原、骨胶原及软骨素(酸性粘多糖),其中的胶原蛋白分子形成一种十分稳定的三股超螺旋结构,不利于人体吸收消化[3],若能将其水解成多肽和氨基酸,有利于提高猪骨素的鲜味、吸收力、营养特性、功能性特征和风味等优势。目前,对猪骨素中蛋白质的水解主要采用酸碱水解法和酶解法。利用化学方法水解猪骨素,存在某些缺陷,如碱法水解可使L-氨基酸转变为D-氨基酸,形成有毒物质,且水解过程中氨基酸破坏比较多,从而导致呈味效果不突出[4]。酶解法可有效释放出氨基酸和多肽物质,显著提高营养价值,但酶解易使酶解液产生苦味肽,使酶解液呈苦味,导致猪骨素的应用范围大大受限[5]。因此,寻求一种既可增强猪骨素香味,又能避免苦味产生的技术已迫在眉睫。

张宇等[6]报道红曲霉、米曲霉发酵猪骨素可产生多肽、氨基酸和一些挥发性风味物质,增加呈味效果。微生物发酵过程中,发酵培养基的组成成分,会对发酵效果产生一定的影响,因此,选择合适的培养基,对最终发酵效果的好坏尤为重要。为了进一步提高菌株发酵产以谷氨酸为代表的鲜味氨基酸和总氨基酸的产率,本文以红曲霉-米曲霉双菌组合为出发菌株固态发酵猪骨素,利用复合菌分泌的蛋白酶酶解猪骨素产谷氨酸和其它氨基酸,以谷氨酸和总氨基酸为指标,在单因素实验的基础上,采用正交实验进一步优化固态培养基组分,确定复合菌固态发酵猪骨素产谷氨酸和总氨基酸的固态培养基组分的最佳配比。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米曲霉A-3(Aspergillusoryzae)、红曲霉M-4(Monascuspurpureus) 由成都大学食品加工四川省高校重点实验室提供;种子培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基):马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,蒸馏水1000 mL,pH7[7];基础固态培养基 麸皮100 g,猪骨素600 g,豆粕粉10 g,补水至1000 g,搅拌均匀,121 ℃湿热灭菌20 min;猪骨素 蛋白质73.1%、氨基酸7.2%、脂肪0.28%、水分16.93%、其它成分2.49%,由四川天添调味品食品公司提供;麦麸、玉米芯、淀粉、豆粕粉 购于四川省成都市十陵镇农贸市场;酪蛋白胨、牛肉膏、尿素、硫酸铵、磺基水杨酸、茚三酮、蔗糖酯、三聚甘油单硬脂酸酯和丙二醇硬脂酸酯 购于上海化学试剂总厂;谷氨酸标品 购于上海生物工程股份有限公司。

pHS-3C型数字酸度计 上海日岛科技有限公司;FA2004电子分析天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;SH-020恒温恒湿发酵箱 上海上器集团实验设备有限公司;LRH系列生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;LDZX-50KBS手轮式不锈钢立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械有限公司;TGL-20M高速台式冷冻离心机 湖南湘仪科学仪器设备有限公司;XW-80A漩涡混合器 江苏麒麟科教设备有限公司;SZ-93A自动双重纯水蒸馏器 上海亚荣生化仪器有限公司;UV741型可见紫外分光光度计 惠普上海分析仪器有限公司;VOSHIN-600R型均质器 江苏无锡沃信仪器有限公司;Deckman 6300型氨基酸自动分析仪 美国贝克曼库尔特有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 固态发酵 基础培养基灭菌冷却后,以1∶1比例接入米曲霉和红曲霉孢子悬浮液(107个/mL),接种量10%,均匀铺在细网筛上放入发酵箱中,发酵温度30 ℃,相对湿度95%～100%,通风量0.2 L·min-1·kg-1,每12 h翻松培养基一次,发酵120 h。

1.2.2 氨基酸的测定 取发酵样品加入等体积的8%磺基水杨酸除去蛋白质和多肽,10000 r/min离心20 min,取上清液经0.5(m滤膜过滤后,采用氨基酸自动分析仪测定样品中的谷氨酸和总氨基酸量。测定条件:缓冲液流量:20 mL/h,茚三酮流量:10 mL/h,柱温:60 ℃,色谱柱:20 cm,分析时间:42 min。

1.2.3 固态发酵培养基的优化

1.2.3.1 不同碳源对氨基酸产量的影响 在基础培养基的基础上,选择麦麸、玉米芯、淀粉3种碳源,添加量为10%(w/w),发酵温度30 ℃,相对湿度95%～100%,通风量0.2 L·min-1·kg-1,每12 h翻松培养基一次,发酵120 h后测定发酵培养基中谷氨酸和总氨基酸量,以确定最佳碳源种类。选择麦麸添加量5%、10%、15%、20%、25%进行单因素实验。

1.2.3.2 不同氮源对氨基酸产量的影响 在基础培养基的基础上,麦麸添加量为10%,选择豆粕粉、蛋白胨、牛肉膏、尿素、硫酸铵5种氮源,添加量为1%(w/w),发酵温度30℃,相对湿度95%～100%,通风量0.2 L·min-1·kg-1,每12 h翻松培养基一次,发酵120 h后测定发酵培养基中谷氨酸和总氨基酸量,以确定最佳氮源种类。选择硫酸铵添加量0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%进行单因素实验。

1.2.3.3 不同表面活性剂对氨基酸产量的影响 在基础培养基的基础上,麦麸添加量为10%,硫酸铵添加量为1%,选择蔗糖酯、三聚甘油单硬脂酸酯和丙二醇硬脂酸酯3种表面活性剂,添加量为0.1%(w/w),发酵温度30℃,相对湿度95%～100%,通风量0.2 L·min-1·kg-1,每12 h翻松培养基一次,发酵120 h后测定发酵培养基中谷氨酸和总氨基酸量,以确定最佳表面活性剂种类。选择三聚甘油单硬脂酸酯添加量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%进行单因素实验。

1.2.3.4 正交实验设计 通过对碳源、氮源和表面活性剂单因素实验,确定正交实验的各因素水平。在单因素实验基础上,设计三因素三水平正交实验,以谷氨酸产量为评价指标,进一步优化固态发酵培养基,确定最佳培养基组分。正交实验因素水平见表1。

表1 正交实验因素水平表

1.3 数据处理与统计分析

数据统计分析,采用SAS软件(SAS Institute,2000)的ANOVA进行分析,采用普通线性模型(GLM)计算,用最小显著性差异检验平均值间的差异,设定5%为显著性差异水平。对每次实验的每个样品做三次重复测定。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基组分对氨基酸产量的影响

2.1.1 不同碳源对氨基酸产量的影响 不同碳源对复合菌固态发酵猪骨素产谷氨酸和总氨基酸的影响如图1所示。复合菌在麦麸的基质上产谷氨酸和总氨基酸能力显著高于玉米芯和淀粉基质(p<0.05)。因此,选择麦麸为最佳发酵碳源,进一步优化麦麸添加量,结果如图2所示。随着麦麸添加量的增加,谷氨酸和总氨基酸产量呈先增大后下降的趋势,当添加量为15%时,谷氨酸和总氨基酸产量最高,分别达到114.2 g/kg和627.6 g/kg。此后,随着麦麸添加量增加,谷氨酸和总氨基酸产量呈下降趋势。在固态发酵培养基中添加麸皮,不仅可以补充培养基中不足的碳源和维生素,而且能增加基质的透气性,并保持培养基中水分不散失,有利于菌体生长和发酵[8]。但麸皮添加量也不能太高,过高的麸皮的添加量增加基质的C/N,会使米曲霉和红曲霉的菌丝体生长过旺,呼吸作用强,微生物产生的有害物质增多,抑制菌体发酵产酶能力,导致氨基酸的产量降低[9]。

图1 不同碳源对谷氨酸和总氨基酸产量的影响Fig.1 Effects of different carbon sources on Glutamic acid and total amino acids production

图2 麸皮添加量对谷氨酸和总氨基酸产量的影响Fig.2 Effects of wheat bran concentration on Glutamic acid and total amino acids production

2.1.2 不同氮源对氨基酸产量的影响 不同氮源对复合菌固态发酵猪骨素产谷氨酸和总氨基酸的影响如图3所示。有机氮源中,以豆粕粉为氮源,复合菌发酵产谷氨酸和总氨基酸的能力显著高于蛋白胨和牛母膏(p<0.05),这可能是因为豆粕粉除了能提供氮源外,还能提供维生素等其它营养成分,有利复合菌的发酵。无机氮源中,尿素不利于菌体发酵产谷氨酸,添加硫酸铵显著增加发谷氨酸的产量(p<0.05),且产量最高,达132.5 g/kg。硫酸铵比其它无机氮和有机氮有利于发酵产谷氨酸的可能原因是麸皮蛋白质含量达16.4%[10],丰富的有机氮已可满足菌体对有机氮的需要,添加适量硫酸铵后可产生有机氮与无机氮的协同作用。因此,选择硫酸铵为最佳发酵氮源,进一步优化硫酸铵添加量,结果如图4所示。随着硫酸铵添加量的增加,谷氨酸和总氨基酸产量呈先增大后下降的趋势,当添加量1.5%时,谷氨酸产量最高达到140.5 g/kg,总氨基酸产量达到693.5 g/kg。硫酸铵添加量过大,不利于米曲霉和红曲霉菌体的生长,从而导致产酶能力降低,影响谷氨基酸和总氨基酸的产量。

图3 不同氮源对谷氨酸和总氨基酸产量的影响Fig.3 Effects of different nitrogen sources on Glutamic acid and total amino acids production

图4 硫酸铵添加量对谷氨基酸和总氨基酸产量的影响Fig.4 Effects of(NH4)2SO4 concentration on Glutamic acid and total amino acids production

2.1.3 不同表面活性剂对氨基酸产量的影响 添加三聚甘油单硬脂酸酯、蔗糖酯和丙二醇硬脂酸酯3种可食用表面活性剂对复合菌固态发酵猪骨素产谷氨酸和氨基酸的影响如图5所示,其中三聚甘油单硬脂酸酯效果最佳,谷氨酸产量达到164.5 g/kg,总氨基酸产量为723.1 g/kg。郭继平等[11]报道添表面活性剂能促进米曲霉产蛋白酶活力,这可能是因为表面活性剂改变细胞膜的通透性,胞内的酶能更容易透过细胞分泌出来,从而促进酶的分泌。此外,表面活性剂可提高氧在气液界面的传递速率,可增加微生物的溶氧,促进微生物的生长,从而提高菌体产蛋白酶能力,使谷氨酸和总氨基酸的产量提高。选择三聚甘油单硬脂酸酯为最佳表面活性剂,进一步优化三聚甘油单硬脂酸酯添加量,结果如图6所示。三聚甘油单硬脂酸酯添加量为0.3%时谷氨酸量高达164.5 g/kg,总氨基酸产量为723.5 g/kg。

图5 不同表面活性剂对谷氨酸和总氨基酸产量的影响Fig.5 Effects of different surfactants on Glutamic acid and total amino acids production

图6 三聚甘油单硬脂酸酯添加量对谷氨酸和总氨基酸产量的影响Fig.6 Effects of tripolycerol monostearates concentration on Glutamic acid and total amino acids production

2.2 正交优化实验结果

在单因素实验的基础上,选择麸皮、硫酸铵、三聚甘油单硬脂酸酯为3个主要外加营养源。谷氨酸产量为评价指标,通过三因素三水平正交实验确定麸皮、硫酸铵、三聚甘油单硬脂酸酯的浓度对发酵产谷氨基酸的影响,正交实验结果见表2。结果表明,RC>RB>RA,各因素从主到次的顺序为C(三聚甘油单硬脂酸酯),B(硫酸铵),A(麸皮),最优固态培养基组分方案为A1B2C2,即麸皮添加量10%,硫酸铵添加量1.5%,三聚甘油单硬脂酸酯添加量0.3%,在此培养基中复合菌固态发酵猪骨素谷氨酸量达163.5 g/kg。

表2 正交实验结果

2.3 验证性实验

按正交实验优化的培养基成分进行验证实验,以确保实验的准确性。在最优组合条件下,麸皮添加量为10%、硫酸铵添加量为1.5%、三聚甘油单硬脂酸酯添加量为0.3%,此时米曲霉-红曲霉复合菌固态发酵产谷氨酸量为167.8 g/kg,总氨基酸产量为728.6 g/kg,而正交实验2组实验谷氨酸产量最高为163.5 g/kg,基础培养基谷氨酸产量为105.6 g/kg,总氨基酸产量为615.4 g/kg,说明优化组合的谷氨酸产量高于正交实验结果中最高产量,故本研究确定的固态发酵培养基组成合理可信。

3 结论

通过单因素实验,初步确定了有利于米曲霉-红曲酶复合菌固态发酵谷氨酸和总氨基酸的碳源为麸皮,添加量为10%(w/w);氮源为硫酸铵,添加量为1.5%(w/w);表面活性剂为三聚甘油单硬脂酸酯,添加量为0.3%(w/w)。在单因素实验的基础上,采用正交实验对固态培养基组分进行了优化,比较了麸皮、硫酸铵、三聚甘油单硬脂酸酯三个因素对菌株发酵产谷氨酸的影响,三个因子对谷氨酸的影响作用由大到小依次为:三聚甘油单硬脂酸酯、硫酸铵、麸皮;最终确定复合菌固态发酵谷氨酸的最佳发酵培养基组分为:麸皮100 g,猪骨素600 g,硫酸铵15 g,三聚甘油单硬脂酸酯3 g,补水至1000 g。在此条件下,30 ℃发酵5 d,谷氨酸产量达到167.8 g/kg,总氨基酸产量达到728.6 g/kg。

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Optimization of medium constituents for Glutamic acid production by mixed starter cultures in pig ossein solid state fermentation

WANG Xin-hui1,ZHANG Chao2,ZHU Wen-you2,XIAO Long-quan1,LI Jing1,HUANG Yan-lin1

(1.School of Pharmacy and Bioengineering,Chengdu University,Chengdu 610106,China; 2.Key Laboratory of Fermentation Resource and Application of Institutes in Sichuan Higher Education,Yibin University,Yibin 644000,China)

The medium constituents for producing Glutamic acid by a mixed starter culture composed ofAspergillusoryzaeandMonascuspurpureusin pig ossein solid state fermentation were optimized. The effects of carbon sources,nitrogen sources and surfactants on the yield of Glutamic acid and total amino acids were studied by single factor and orthogonal array design methods. Results suggested that the optimal medium constituents were bran concentration of 100 g,pig ossein concentration of 60 g(NH4)2SO4concentration of 15 g and tripolycerol monostearates concentration of 3 g. Under these conditions,the yields of Glutamic acid and total amino acids were 167.8 g/kg and 728.6 g/kg,respectively,after a fermentation 5 days at 30 ℃.

Aspergillusoryzae;Monascuspurpureus;pig ossein;Glutamic acid

2016-06-13

王新惠(1982-)，女，博士,副教授，主要从事肉类加工及质量控制的研究，E-mail：wangxinhui19820319@163.com。

发酵资源与应用四川省高校重点实验室开放基金项目(2015FJZ003)；国家自然科学基金资助项目(31301552)；成都大学大学生创新性实验项目(CDU-CX-2016051)。

TS251

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000