香橼精油体外抗氧化及其抑菌活性研究

刘春菊,牛丽影,*,郁 萌,李大婧,刘春泉

(1.江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏南京 210014;2.国家蔬菜加工技术研发专业分中心,江苏南京 210014)

香橼精油体外抗氧化及其抑菌活性研究

刘春菊1,2,牛丽影1,2,*,郁 萌1,李大婧1,2,刘春泉1,2

(1.江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏南京 210014;2.国家蔬菜加工技术研发专业分中心,江苏南京 210014)

为了研究香橼精油的抗氧化性及对细菌、酵母和霉菌的抑菌活性,本文采用体外抗氧化法和琼脂平板扩散法,研究香橼精油总还原力,清除DPPH自由基、·OH自由基和H2O2能力,以及对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、黑曲霉的抑制作用。结果表明:香橼精油的抗氧化能力与质量浓度呈正相关,对DPPH自由基、·OH自由基(IC50值为0.32 mg/mL)和H2O2(IC50值为148 μg/mL)均有一定的清除能力。香橼精油对霉菌的抑制作用明显强于酵母与细菌,其中对黑曲霉的抑制效果最显著(25.39±1.12) mm,对金黄色葡萄球菌抑制最弱(14.04±1.35) mm。最小抑菌浓度在0.31～1.25 mg/mL,且在pH3～8范围内、温度80、115、121 ℃及一定时间紫外线照射(20、40、60 min)影响下,对大肠杆菌和酿酒酵母仍保持较强的抑制作用。

香橼,精油,抗氧化,抑菌

香橼(CitrusmedicaL.)为芸香科柑橘属,是我国传统观赏植物及中药,已有二千余年的栽培历史。近几年来,香橼树因其观赏价值与香橼的怡人香气,成为苏浙地区重要的园林树种,香橼的产量已达3000 t以上。香橼具有理气宽中,消胀降痰之功效,可缓解胃腹胀痛、呕吐等症状[1]。香橼的果皮富含丰富的精油,占干重的6.5%～9%,主要由萜烯类碳氢化合物及含氧衍生物组成,药效成分为柚皮苷,精油含量略高于枸橼[2-3]。

芸香科柑橘属类植物为重要的植物精油来源,不仅作为天然的食品添加剂和赋香剂,广泛应用于饮料、焙烤食品、糖果、冷饮等领域,也是日化、美容等行业应用最广泛的精油之一。柑橘类精油成分复杂,挥发性强,具有镇痛、消炎、抗病毒、抗菌和抗氧化等多种生物活性功效[4]。如柚皮精油对亚油酸的过氧化表现出较强的抑制作用[5],葡萄柚精油可有效抑制大肠柑橘、黑曲霉、金黄色葡萄球菌等多个菌种生长,具有广谱抗菌性[6]。Choi等[7]对34种柑橘精油研究发现其对DPPH自由基清除率在17.7%～64.0%,其中有31种高于同等浓度的水溶性维生素E。基于柑橘类精油的生理活性,其作为药品原料、功能食品基料及食品添加剂具有广阔的应用和开发前景,需求将日益增加。因此,本文以自制香橼精油为对象,研究香橼精油总还原力、清除自由基能力,以及对黑曲霉、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的抑菌活性,探讨香橼精油在抗氧化和抑菌抗菌以及食品防腐领域的应用效果,旨在为香橼精油活性成分的深度开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香橼 江苏省靖江市;柑橘 江苏南京苏果超市2,2-二苯基-1-三硝基苯肼(DPPH) 美国sigma公司;抗坏血酸(VC)、丁基甲基苯酚(BHT)、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、无水乙醇、过氧化氢、七水合硫酸亚铁、水杨酸、牛肉膏、琼脂、葡萄糖、氯化钠、丙酮、氢氧化钠、盐酸 分析纯;供试菌种:黑曲霉(Aspergillumniger)、酿酒酵母(Saccharmoycescerevisiae)、大肠杆菌(Escherichiacoli,G-)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,G+)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis,G+) 南京师范大学金陵女子学院微生物实验室;牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏、蛋白胨、琼脂(液体培养基不含琼脂)、水;PDA培养基:酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、琼脂(液体培养基不含琼脂)、水。

FA2104电子分析天平 北京赛多利斯科学仪器公司;TF16-WS台式高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;HH-8 数显恒温水浴锅 江苏省荣华仪器有限公司;TU-1810紫外分光光度计 北京普析通用仪器制造有限公司;PB-10 pH计 北京赛多利斯科学仪器公司;722型可见分光光度计 上海棱光技术公司;6 mm打孔器 宁波得力集团;SYQ-DSX-280B型手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅 上海中安医疗器械厂;SW-CJ-2D型超净工作台 郑州宏郎仪器设备有限公司;DNP-9052BS-Ⅲ型电热恒温培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司。

1.2 香橼精油和柑橘精油提取

新鲜的香橼或柑橘清洗干净,沥干外表皮上的水分,将香橼或柑橘果皮与果肉分离,粉碎香橼或柑橘果皮至粒度为20 mm左右,按固液比1∶2(w/v)添加3%氯化钠,水蒸气蒸馏3 h,油水混合物分层,上层液体即为香橼或柑橘精油。将精油移入棕色瓶中,加入少许无水硫酸钠,剧烈振摇至无水分存在于精油中,将处理后精油进行过滤,然后将其置于干净、干燥的棕色瓶中,于4 ℃冰箱内保存,备用。

1.3 香橼精油抗氧化能力测定

1.3.1 香橼精油总还原力测定 用无水乙醇配置10 mg/mL香橼精油溶液,将其稀释至质量浓度为0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL。分别取1 mL上述香橼精油溶液于试管中,依次加入2.5 mL 0.02 mol/L磷酸缓冲液(pH6.6),2.5 mL 1%铁氰化钾溶液,50 ℃水浴20 min后,加入2.5 mL质量浓度10%的三氯乙酸溶液,混匀,1000 r/min离心10 min,取上清液2.5 mL于试管中,加去离子水2.5 mL和0.1%三氯化铁0.5 mL,混合均匀后,常温反应5 min,于700 nm波长处测定吸光值[8],VC和BHT为阳性对照,每组平行3次。

1.3.2 DPPH自由基清除能力测定 按照1.3.1稀释成不同浓度的香橼精油,分别取各浓度的香橼精油1 mL与2 mL 2 mmol/L DPPH溶液混匀后,室温下避光反应15 min,于517 nm下测定吸光值,空白组香橼精油溶液以无水乙醇代替,并以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液为空白调零,VC和BHT为阳性对照[9],每组平行3次。

DPPH清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100

式(1)

其中:A1为3 mL样品溶液与2 mL DPPH溶液;A2为3 mL样品溶液与2 mL无水乙醇;A3为3 mL蒸馏水与2 mL DPPH溶液。

1.3.3 H2O2清除能力测定 按照1.3.1稀释成不同浓度的香橼精油,分别取各浓度的香橼精油2.5 mL与2.5 mL 10 mmol/L H2O2溶液混合均匀,于230 nm波长下测定吸光值,VC和BHT为阳性对照[10],每组平行3次。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100

式(2)

其中:A1为2.5 mL样品溶液+2.5 mL H2O2溶液;A2为2.5 mL样品溶液+2.5 mL无水乙醇;A3为2.5 mL蒸馏水+2 mL H2O2溶液。

1.3.4 ·OH自由基清除能力测定 按照1.3.1稀释成不同浓度的香橼精油,分别取各浓度的香橼精油1 mL加入含1 mL 8.8 mmol/L H2O2、1 mL 9 mmol/L FeSO4、1 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液反应体系中,最后加入1 mL H2O2启动反应,于37 ℃下反应30 min,以蒸馏水作为空白,在510 nm下测定吸光值,每组平行3次。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100

式(3)

其中:A1为1 mL样品溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL水杨酸-乙醇溶液+1 mL H2O2溶液;A2为1 mL样品溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL水杨酸乙醇溶液+1 mL无水乙醇;A3为1 mL蒸馏水+1 mL FeSO4溶液+1 mL水杨酸乙醇溶液+1 mL H2O2溶液。

1.4 香橼精油抑菌活性测定

1.4.1 菌株活化与菌悬液制备 用灭菌接种环分别挑取细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)、酵母菌和黑曲霉菌株于营养琼脂平板上划线培养,细菌置于恒温培养箱37 ℃下培养24 h,酵母菌和黑曲霉分别于28 ℃下培养24 h和48 h。然后挑取单菌落接种于营养琼脂斜面培养基上扩大培养,继续按照上面的条件培养,获得活化菌体。从经过活化的菌体斜面上挑取一环菌体接种于相应液体培养基中,放入恒温振荡培养箱培养至对数生长期,分别吸取以上培养菌液,加入无菌水稀释至菌落数为105～106CFU/mL,备用。

1.4.2 香橼精油抑菌圈测定 采用纸片琼脂扩散法测定抑菌活性,使用打孔器将定性滤纸制成直径为6 mm小圆纸片,高压灭菌后备用,每个平皿上呈正三角形放置3片滤纸片,每片滴加8 μL精油,滤纸片之间间隔一定距离。以无菌蒸馏水为空白对照,以自制柑橘精油为阳性对照,恒温培养箱内培养,细菌37 ℃培养24 h,霉菌28 ℃培养48 h,酵母28 ℃培养24 h。测定抑菌圈直径,重复3次。

1.4.3 最小抑菌浓度(MIC)测定 以丙酮为溶剂,运用纸片琼脂扩散法和半数稀释法,将香橼精油稀释至不同浓度,吸取9 mL液体培养基与1 mL香橼精油丙酮溶液混匀,依次得到精油浓度为5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08 mg/mL的平板培养基。待培养基冷却凝固后,平板划线接种[11],按1.4.1所述条件培养,观察平板上菌体生长情况,每个精油浓度梯度作3组平行实验,与对照组(菌落正常生长)比较,有菌落生长者为无抑制作用,以完全无菌落生长的最低精油浓度为其最低抑菌浓度,丙酮和无菌水为空白对照。

1.4.4 pH对香橼精油抑菌活性的影响 采用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCI溶液分别将培养基的pH调节为3、4、5、6、7、8,并制备培养平板,建立不同pH梯度的系列培养基,选取大肠杆菌、酿酒酵母为实验菌,每片载体滤纸片滴加8 μL香橼精油。大肠杆菌于37 ℃培养24 h,酿酒酵母于28 ℃下培养24 h,测量抑菌圈大小,每组3次重复。

1.4.5 热处理对香橼精油抑菌活性的影响 将香橼精油原液分别置于80、100、121 ℃的环境中,处理30 min,对照组精油样品置于30 ℃放置30 min;以大肠杆菌、酿酒酵母为实验菌,采用纸片琼脂扩散法,测量抑菌圈大小,每组3次重复。

1.4.6 紫外线照射对香橼精油抑菌活性的影响 将香橼精油原液分别置于40 W紫外灯管下照射20、30、60 min,以无紫外照射的精油为对照组,选择大肠杆菌、酿酒酵母为实验菌,采用纸片琼脂扩散法,测量抑菌圈大小,每组3次重复[12]。

1.5 数据分析方法

2 结果与分析

2.1 香橼精油抗氧化能力

2.1.1 香橼精油总还原力 抗氧化剂是通过自身还原作用,给出电子而清除自由基,还原能力越强,抗氧化性能越强[13]。由图1可知,香橼精油、阳性对照BHT和VC的还原能力与质量浓度均呈正相关。当质量浓度为0.4 mg/mL时,VC与BHT的总还原力无显著差异,香橼精油还原力低于VC与BHT。当质量浓度大于0.4 mg/mL时,VC与BHT总还原力继续升高,香橼精油总还原力增长变缓。质量浓度为1.0 mg/mL时,还原力最大为BHT、其次是VC,还原力最小为香橼精油。

图1 香橼精油的总还原能力Fig.1 Reducing power of Citrus medica essential oil

2.1.2 香橼精油对DPPH自由基清除能力 DPPH是一种以氮为中心,依靠3个苯环空间排布形成共振稳定性的有机自由基,DPPH的单电子在517 nm处有强吸收,可使其醇溶液呈紫色,而当有自由基清除剂存在时,可与其单电子配对而使吸收逐渐消失,醇溶液褪色程度与其接受的电子数呈量效关系,因而可用分光光度计快速检测自由基清除剂的抗氧化能力[14-15]。

由图2可知,香橼精油、BHT和VC均有清除DPPH自由基的能力,且香橼精油和VC在测量的质量浓度范围内,清除DPPH自由基能力与质量浓度呈正相关。而VC对DPPH自由基的清除率则一直维持较高水平,均在90%以上,BHT次之。3种测试样品中,香橼精油清除DPPH自由基的能力最弱,在最高浓度10 mg/mL时,清除率为26.1%,VC对DPPH自由基清除率为96.12%。

图2 香橼精油清除DPPH自由基能力Fig.2 DPPH radical scavenging capacities of Citrus medica essential oil

2.1.3 香橼精油对·OH自由基清除能力 ·OH自由基是自然界中仅次于氟的氧化剂,具有极强的得电子能力,可对机体造成各种氧化损伤,从而引发细胞病变,导致各种疾病及加速机体衰老。而通过抗氧化剂的清除作用,可减轻或减少因·OH引发的各种疾病与损伤[16]。

由图3可知三种样品对·OH自由基的清除能力随质量浓度增加而增大,质量浓度较低时,BHT与香橼精油清除能力较强,但随质量浓度增加,清除率增大趋势变缓;VC对·OH自由基的清除率几乎呈线性关系,增速较快。当质量浓度小于0.2 mg/mL时,BHT的清除能力最强,其次为香橼精油,最后为VC;当质量浓度大于0.2 mg/mL时,VC清除率继续快速升高,BHT及香橼精油对自由基清除能力增长不显著(p>0.05)。当质量浓度为0.5 mg/mL时,VC、BHT和香橼精油对·OH的清除率分别为88.34%、62.62%和53.78%。香橼精油、VC与BHT清除·OH自由基的IC50值为0.32、0.19、0.22 mg/mL。

图3 香橼精油对·OH自由基清除能力Fig.3 ·OH scavenging activity of Citrus medica essential oil

2.1.4 香橼精油对H2O2清除能力 H2O2是一种活性氧,是有氧代谢氧化还原反应产生的中间产物之一,体内过多氧自由基可损伤细胞结构,导致机体产生多种疾病。由图4可知,香橼精油、BHT和VC对H2O2的清除能力与质量浓度呈正相关,不同抗氧化剂质量浓度与H2O2清除率呈量效关系。质量浓度为0.2 mg/mL时,BHT对H2O2的清除率最高为67.23%,其次为VC,清除率为62.55%,最后为香橼精油,清除率为53.02%。香橼精油、VC与BHT清除H2O2的IC50值为148、95、46 μg/mL。

图4 香橼精油对H2O2的清除能力Fig.4 H2O2 scavenging activity of Citrus medica essential oil

2.2 香橼精油抑菌活性

2.2.1 香橼精油抑菌圈直径大小 抑菌圈实验结果判定标准为:抑菌圈直径大于15 mm为高度敏感、10～15 mm为中度敏感,7～9 mm为低度敏感、无抑菌圈者为不敏感[17]。

图5为各供试菌种产生抑菌圈图,同时由表1可知,香橼精油对黑曲霉、酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均有较强的抑制作用,其抑菌圈直径分别为(25.39±1.12)、(17.25±1.09)、(16.59±0.80)、(16.19±1.73) mm,都大于15 mm,属于高度敏感,对金黄色葡萄球菌抑菌直径为(14.04±1.35) mm属于中度敏感。对五种供试菌而言,香橼精油对霉菌的抑制作用强于细菌和酵母。与实验室自制柑橘皮精油对照比较可知,香橼精油与柑橘精油抑菌活性有极显著差异(p<0.01),香橼精油对霉菌的抑制能力明显强于柑橘精油,抑制酵母菌能力略低于柑橘精油,而抑制细菌能力则随菌种不同有所差异。

表1 香橼精油对供试菌种的抑菌圈测定效果

注:“-”为无抑菌圈出现,不同小写字母表示同列差异显著(p<0.05),不同大写字母表示同行差异极显著(p<0.01)。

2.2.2 香橼精油的最低抑菌浓度(MIC) 由表2可知,香橼精油对黑曲霉、酿酒酵母、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为0.31、0.63、1.25、1.25、1.25 mg/mL。香橼精油对黑曲霉与酿酒酵母的抑制作用较强。

植物精油成分较为复杂,其抑菌活性主要是由于一些低分子量物质的存在,如酚类、萜烯类和醛酮类物质。这些物质的单体已经被证实具有很好的抑菌效果[18],另外,许多在精油中含量较低的成分,如α-蒎烯、β-蒎烯、萜品烯、异松油烯等,也被证实对精油抑菌活性有很重要的作用[19]。

作为香橼精油中含量最高的成分柠檬烯,有报道表明,柠檬烯对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、和黑曲霉都具有较好的抑制效果,具有广谱抗菌性[20-21];对面包酵母、啤酒酵母和黑曲霉的抑制作用甚至强于苯甲酸钠和山梨酸钾等化学防腐剂,但柠檬烯对金黄色葡萄球菌抑制效果较差[22],这与本实验结果保持一致。

酚类物质也是植物精油抗菌的主要活性成分之一,香橼精油中含有少量香芹酚,它可使细胞膜中的蛋白质变性,并与细胞膜中的磷脂反应破坏细胞膜的渗透性,破坏细胞膜上的磷脂双分子层的同时,攻击破坏其酶系统,抑制细菌保护酶的活性,还可导致细胞脂质和蛋白质损失,从而抑制微生物的生长[23]。

表2 香橼精油最低抑菌浓度(MIC)测定效果

注:“+”有菌落生长,“-”无菌落生长。

表3 香橼精油在不同pH条件下的抑菌效果

注:同行不同字母表示差异显著(p<0.05),图4、图5同。

表4 热处理对香橼精油抑菌活性的影响

表5 紫外线照射对香橼精油抑菌活性的影响

2.2.3 pH对香橼精油抑菌活性的影响 香橼精油在不同pH条件下对实验菌种大肠杆菌与酿酒酵母的抑制效果见表3。香橼精油对大肠杆菌的抑制作用随pH升高,先增强后又减弱,在pH=5与pH=6时,抑菌圈大小无显著差异(p>0.05),均大于15 mm,对大肠杆菌抑制能力属高度敏感。在整个pH范围内,抑菌活性较为稳定,均保持于高度或中度敏感,pH为5时,抑菌圈直径最大,为(16.66±1.15) mm。对酿酒酵母的抑制,在pH为5时达到最强,抑菌圈直径为(17.21±1.10) mm;在pH为3时,抑菌圈最小,直径为(11.85±0.61) mm。酵母菌为喜酸菌种,在pH4～5的酸性环境下可以较好生长,而香橼精油,在pH4～8范围内对酵母菌保持较强的抑制能力,抑菌圈直径均大于15 mm,属高度敏感抑制。

2.2.4 热处理对香橼精油抑菌活性的影响 热处理前后香橼精油对大肠杆菌和酿酒酵母的抑菌效果见表4,香橼精油在80、115、121 ℃下处理30 min后,仍保持高度抑菌敏感性。

香橼精油在121 ℃处理后,抑制大肠杆菌及酿酒酵母活性最高,精油抑菌活性虽上下波动,对供试菌种却始终保持高度敏感;当处理温度为121 ℃时,香橼精油对大肠杆菌及酿酒酵母菌的抑菌圈为最大,抑菌圈直径分别为(16.85±0.96) mm和(17.57±1.41) mm,且与对照组无显著性差异,表明精油具有较好的抑菌热稳定性。

2.2.5 紫外线照射对香橼精油抑菌活性的影响 紫外线照射20、40、60 min,香橼精油对大肠杆菌和酿酒酵母的抑菌活性见表5。从表5中可看出,紫外照射40 min时,对酿酒酵母抑制能力最强,抑菌圈直径为(17.59±1.36) mm,照射20 min时,对大肠杆菌抑制能力最强,抑菌圈直径为(16.77±1.43) mm,照射40 min时处理组香橼精油抑制大肠杆菌活性与对照组相比无显著差异(p>0.05)。抑菌圈大小仍都保持在15 mm以上,仍属于高度敏感范围内。可确认,一定时间范围内紫外线照射对香橼精油的抑菌活性无显著影响,说明香橼精油在一定时间范围紫外线照射影响下,抑菌性能保持稳定。

3 结论

采用体外抗氧化模型及纸片琼脂扩散法,研究香橼精油的抗氧化及抗菌活性。发现香橼精油的抗氧化能力与质量浓度呈正相关,对DPPH自由基、·OH自由基(IC50值为0.32 mg/mL)和H2O2(IC50值为148 μg/mL)均有一定的清除能力。香橼精油对黑曲霉、酿酒酵母、大肠杆菌、金黄葡萄球菌和枯草杆菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为0.31、0.63、1.25、1.25、1.25 mg/mL。香橼精油对霉菌的抑制作用明显强于酵母与细菌,其中对黑曲霉的抑制效果最显著,且在pH5～7范围、温度80～121 ℃及紫外线照射20～40 min条件下,对大肠杆菌和酿酒酵母仍保持较强的抑制作用(抑菌圈直径(15 mm)。

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Study on antioxidant and antibacterial activities of essential oils fromCitrusmedica

LIU Chun-ju1,2,NIU Li-ying1,2,*,YU Meng1,LI Da-jing1,2,LIU Chun-quan1,2

(1.Institute of Agricultural Products Processing,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China; 2.National Vegetable Processing Technology R&D Sub-centers,Nanjing 210014,China)

The objective was to study the antioxidant activities and the antibacterial activities to bacteria,yeasts and molds of essential oil fromCitrusmedica. The antioxidant activities of essential oil fromCitrusmedicawere evaluated based on the method of vitro antioxidant and agar diffusion. The results for the antioxidant capacity of essential oil fromCitrusmedicaincreased with the increasing concentration,there were scavenging capacity on DPPH free radicals,·OH free radicals(IC50=0.32 mg/mL)and H2O2(IC50=148 μg/mL). The antimicrobial activity and its stability of the essential oils against five species of microorganisms(Escherichiacoli,Staphylococcusaureus,Bacillussubtilis,Saccharomycescerevisiae,Aspergillusniger)were discussed by the disc diffusion method. The essential oils showed inhibition zones against all microorganisms tested. The data indicated thatAspergillusnigerwas the most sensitive microorganism tested with the largest inhibition zone(25.39±1.12) mm,andStaphylococcusaureusexhibited the smallest inhibition zone(14.04±1.35) mm. Minimum inhibitory concentrations ranged from 0.31～1.25 mg/mL. At the certain range of pH(3～8),temperature(80,115,121 ℃)and ultraviolet rays(20,40,60 min)impact compared with the control,essential oil fromCitrusmedicaremained relatively stable antimicrobial properties. The essential oil displayed a broad antimicrobial spectrum and exerted a strong antimicrobial effect against five strains tested.

Citrusmedica;essential oil;antioxidant;antibacterial

2016-06-13

刘春菊(1979-)，女，硕士，助理研究员，主要从事果蔬加工与质量控制研究，E-mail：cjliu0306@163.com。

*通讯作者:牛丽影(1977-)，女，博士，副研究员，主要从事果蔬加工研究，E-mail:liying.niu@hotmail.com。

公益性行业(农业)科研专项经费项目(201503142)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000