广西壮族人群白细胞介素-27基因rs181206C/T位点多态性的分布特点▲

胡仁统 王俊利 韦叶生 陆 潞 韦贵将 黄 可 廖品琥 唐毓金

(右江民族医学院附属医院检验科，百色市 533000，E-mail：hurentong@163.com)

论著·基础研究

广西壮族人群白细胞介素-27基因rs181206C/T位点多态性的分布特点▲

胡仁统 王俊利 韦叶生 陆 潞 韦贵将 黄 可 廖品琥 唐毓金

(右江民族医学院附属医院检验科，百色市 533000，E-mail：hurentong@163.com)

目的 探讨广西壮族人群白细胞介素-27(IL-27)基因rs181206C/T位点的分布特点及其与不同地区和种族人群的差异。方法 采用单碱基延伸的聚合酶链反应技术检测168例广西壮族人IL-27 rs181206C/T多态性，并与国际人类基因组计划(HapMap)公布的中国北京人、日本人、非洲人和意大利人的rs181206C/T位点的基因型和等位基因频率比较。结果 168例广西壮族人中，检出rs181206C/T位点有3种基因型，分别为CC、CT和TT。IL-27基因rs181206C/T位点最常见的基因型是TT(75.1%)，最常见的等位基因型是T(85.7%)。男性及女性间IL-27基因rs181206多态性位点基因型及等位基因频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；广西壮族人IL-27 rs181206C/T基因型及等位基因频率与北京人、日本人比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但与意大利人、非洲人比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 IL-27基因rs181206C/T位点基因型和等位基因频率在广西壮族人群中的分布与其他种族和地区人群相比有差异。

白细胞介素-27；基因多态性；广西；壮族

白细胞介素(interleukin，IL)-27是由Pflanz等在2002年首先发现，它是一个由IL-27p28和EB病毒诱导基因3亚单位组成的异二聚体细胞因子[1]。IL-27属于IL-12细胞因子家族，因此与家族其他成员(IL-12、IL-23、IL-35)一样，具有很多共同的结构特征和生物学功能，而其生物学功能主要是在适应性免疫系统及固有免疫系统中具有调节作用[2-3]。研究显示，IL-27基因存在多种功能性多态性位点，而且这些多态性位点的遗传易感性对多种疾病的发生发展有影响，例如自身免疫性疾病[4]、恶性肿瘤[5]、结核病[6-7]等。因此，分析IL-27基因多态性在不同地区以及不同人群中的分布特点，可为探讨IL-27基因多态性与某些疾病的发生发展的相关性提供更多实验依据，同时能进一步揭示IL-27基因多态性生物学功能和遗传特性。本文采用SNaPshot单核苷酸多态性(single nuaeotide polymorphism，SNP)分型技术检测168例广西壮族人群IL-27基因rs181206C/T位点的遗传多态性分布特点，并与国际人类基因组计划(HapMap)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的北京、日本、意大利和非洲等地人群相应的位点进行比较分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 168份检测样本取自广西右江民族医学院附属医院体检的健康人员，样本收集时间为2012年10月至2013年10月。受试者各项临床及实验室检查指标均正常，籍贯均为广西，且长期在广西居住，向上追溯3代均为壮族的个体，无可查亲缘关系；男98例，女70例，年龄18～71(39.53±14.39)岁。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取：抽取空腹静脉血2 ml，置入含乙二胺四乙酸-K2抗凝剂的血常规管保存；采用改良碘化钠法提取白细胞总DNA，DNA保存-80℃冰箱备用。

1.2.2 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)：根据美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)找到IL-27基因DNA全序列，选择包含rs181206C/T位点的片段，通过Primer 5引物设计软件设计出特异性最好且包含rs181206C/T位点的PCR上、下游引物和延伸引物。其中，rs181206C/T位点的上游引物序列为：5′-CAGCTGCATCCTCTCCATGTTG-3′，下游引物序列：5′-GCTGAGGTGGGGGAAGAGCTAC-3′，延伸引物序列为：5′-TTTTGGTCCCCAGCCCTCCCAGC-3′。然后进行PCR扩增反应，反应体系为20 μl：0.3 mmol/L dNTPs 2.0 μl，10×PCR反应缓冲液2.0 μl，上、下游引物各1.0 μl，DNA 1.0 μl，TaqDNA聚合酶1.0 U，总体积不足20 μl用灭菌双蒸水补充。PCR 反应条件：94℃ 15 min；94℃×30 s，60℃×30 s，72℃×20 s，共设35个循环，然后72℃×10 min。最后PCR扩增产物于4℃保存备用。

1.2.3 SNaPshot SNP分型技术：PCR扩增产物首先用虾碱酶和外切酶Ⅰ(北京盛科公司)处理纯化后，用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit试剂(上海慧颖生物科技有限公司)进行延伸反应。延伸产物通过虾碱酶再次纯化，然后采用ABI 3130XL测序仪对纯化产物进行测序，最后用Gene Mapper 4.0(ABI公司)软件对rs181206C/T位点进行分型分析。

1.2.4 数据处理及来源：根据测序结果直接计算rs181206C/T位点基因型和等位基因频率；登陆NCBI查找HapMap公布的北京人、日本人、非洲人和意大利人的rs181206C/T位点的基因型和基因频率结果。

1.3 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计数资料比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计意义。

2 结 果

2.1 IL-27 基因rs181206C/T位点SNP分型结果 PCR扩增IL-27基因rs181206C/T位点的产物片段长度为218 bp，通过ABI 3130XL的SNP分型，结果显示rs181206C/T位点有3种基因型，分别为CC、CT和TT，见图1。

图1 IL-27基因rs181206C/T位点SNP分型结果

2.2 IL-27基因s181206C/T位点Hardy-Weinberg遗传平衡检测结果 IL-27基因rs181206C/T位点基因型的实际频数和理论频数比较，差异无统计学意义(χ2=0.018，P=0.991)，提示所选广西地区壮族人群人总体代表性较好，见表1。

表1 168名壮族IL-27 rs181206 C/T基因型实际频数与理论频数比较(例)

2.3 IL-12基因rs181206C/T位点在广西壮族人群中的分布 168名壮族人中，IL-27基因 rs181206C/T位点最常见的基因型是TT，占75.1%；最常见的等位基因型是T，频率为85.7%。该位点基因型及等位基因频率在广西壮族男女组间比较，差异均无统计学意义(基因型：χ2=1.404，P=0.496；等位基因：χ2=0.400，P=0.527)，见表2。

表2 不同性别IL-27基因rs181206C/T位点基因型及等位基因频率比较(n，%)

2.4 IL-27基因rs181206C/T位点与其他地区人群的比较 168名广西壮族人IL-27基因 rs181206C/T位点基因型和等位基因频率与北京人(χ2=0.320，P=0.852；χ2=0.355，P=0.551)、日本人(χ2=0.656，P=0.720；χ2=0.638，P=0.424)比较，差异无统计学意义，但与非洲人(χ2=23.056，P<0.001；χ2=23.095，P<0.001)、意大利人(χ2=9.689，P=0.008；χ2=11.284，P=0.001)比较，差异均有统计学意义，见表3。

表3 不同种族人群IL-27基因rs181206C/T位点基因型及等位基因频率比较(n，%)

3 讨 论

IL-27被发现最早是因为它具有促炎和抗炎作用，主要体现在促进辅助性T细胞1(T helper cell，Th1)反应，因此被称为促炎细胞因子[1，8]。但是单独的IL-27并没有明显的直接刺激性，它只有在与IL-12或IL-2结合的情况下才能诱导NK细胞、T细胞产生促炎物质干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)，并通过IFN-γ发挥作用[1]。有研究显示，IL-27在幼稚CD4+T细胞分化为Th1的过程中起到关键性作用，而WSX-1是IL-27的受体，其在Th1分化中的角色已得到证实。试验研究结果显示，WSX-1表达阴性的大鼠IFN-γ表达量比野生型大鼠少，并且其对于胞内寄生病原体硕大利什曼原虫(Leishmaniamajor，L.major)具有明显的易感性，L.major清除依赖Th1介导的反应[9-10]。然而对于WSX-1表达阴性的大鼠只有在L.major感染早期IFN-γ的表达量才减少，在L.major感染后期，WSX-1表达阴性大鼠IFN-γ的表达量与野生大鼠相当，因此认为IL-27/WSX-1信号只是在CD4+T细胞分化为Th1的初始阶段被需要[11]。IL-27不仅具有促炎及抗炎作用，在机体抗结核免疫过程中，IL-27还具有促进单核巨噬细胞分泌IFN-γ以及促进自然杀伤细胞和CD8+T细胞发挥细胞毒活性等作用，参与免疫应答[12]。

蛋白属于功能物质，在体内的变化可能影响到其发挥相应的生物学功能，而基因则影响到蛋白的合成和分泌，特别是基因某些SNP位点的变化则会抑制或者促进相应蛋白的合成。IL-27基因多态性与疾病发生发展的相关性也得到很多研究者的证实。Zhang等[13]对229例卵巢上皮瘤患者和206例健康人的IL-27基因多态性检测发现，病例组rs153109位点CC、CT和TT基因型频率和rs17855750位点GG、GT和TT基因型频率与健康人群组比较差异均有统计学意义，且在病例组患者中IL-27 rs17855750位点基因型GG和GT频率明显高于对照组，提示IL-27基因多态性与上皮卵巢癌的易感性相关。Nematollahi等[14]研究发现IL-27基因rs964位点基因型AA、AG和GG频率在反复流产组与正常对照组间有差异，提示IL-27基因rs964可能是妇女反复流产的一个危险因素。Zhou等[5]研究发现IL-27基因rs153109位点和rs17855750位点可能是引起膀胱癌的一个易感因素，并且膀胱癌患者IL-27蛋白表达水平降低。

很多研究已经表明IL-27基因多态性与一些疾病的发生发展有关，但目前有关IL-27基因多态性在不同地区、不同人群中是否有差异的研究报告还比较少，为了探讨不同地区、不同人群中IL-27基因多态性的分布情况，本课题组采用单碱基延伸的PCR技术检测168例广西壮族人IL-27 rs181206C/T多态性，并与国际人类基因组计划(HapMap)公布的中国北京人、日本人、非洲人和意大利人的rs181206C/T位点的基因型和等位基因频率进行比较，结果显示，168例广西壮族人中，男性与女性的rs181206C/T位点基因型和等位基因频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，说明该位点基因型分布可能与性别无关。而广西壮族人的rs181206C/T位点基因型、等位基因频率与亲缘关系最近的北京人、日本人比较，差异也无统计学意义(P>0.05)，但是与亲缘关系较远的非洲人、意大利人比较，差异有统计学意义(P<0.01)。这表明此位点基因型分布可能与地域和种族存在一定的关联性，也符合“亲缘关系越近，其基因型分布越相似，亲缘关系越远，差异越显著”的遗传学规律。同时也说明了在种族进化过程中存在地域和种族的异质性，而这种遗传异质性很可能是导致某些地域和种族高发某种疾病及同种疾病临床表现不同的诱导因素之一。这为后续探讨rs181206C/T位点与广西地区某些高发疾病的相关性研究提供参考。

总之，广西壮族人IL-27基因rs181206C/T位点基因多态性分布与不同地区人群有一定差异，这为进一步研究与IL-27相关的疾病，尤其是研究广西地区某些特异性高发疾病与IL-27基因多态性相关性提供重要参考依据。

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Distribution characteristics of polymorphism of interleukin-27 rs181206 C/T gene locus in Guangxi population with Zhuang nationality

HURen-tong,WANGJun-li,WEIYe-sheng,LULu,WEIGui-jiang,HUANGKe,LIAOPin-hu,TANGYu-jin

(DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,China)

Objective To explore the distribution characteristics of polymorphism of interleukin-27(IL-27) rs181206C/T gene locus in Guangxi population with Zhuang nationality,and the difference in polymorphism between this population and other population in different areas or with different races.Methods The polymorphism of IL-27 rs181206 gene locus was detected by single-base extension polymerase chain reaction technique in 168 individuals with Zhuang nationality from Guangxi.The genotype and allele frequencies of rs181206 gene locus were compared between the population with Zhuang nationality and population from China Beijing,Japan,Africa or Italy published by HapMap.Results In 168 individuals with Zhuang nationality from Guangxi,three genotypes of rs181206C/T gene locus were detected including CC,CT and TT.The most common genotype and allele of IL-27 rs181206C/T gene locus were TT(75.1%) and T(85.7%) respectively.There were no significant differences in the genotype and allele frequencies of IL-27 rs181206C/T gene locus between the male and the female(P>0.05).There were no significant difference in the genotype and allele frequencies of IL-27 rs181206C/T gene locus between Guangxi population with Zhuang nationality and the population from Beijing or Japan(P>0.05),but significant difference was found between Guangxi population with Zhuang nationality and the population from Italian or African(P<0.05).Conclusion There are significant differences in the frequencies of genotype and allele distribution of IL-27 rs181206C/T gene locus between Guangxi population with Zhuang nationality and the populations with other races or from other areas.

Interleukin-27,Gene polymorphism,Guangxi,Zhuang nationality

国家自然科学基金(81260315、81541136)；广西自然科学基金(2012GXNSFAA053169)；广西医药卫生科研课题(Z2014520)；百色市科技攻关项目(20160610)

胡仁统(1988～)，男，硕士，检验技师，研究方向：恶性肿瘤的临床分子诊断研究。

唐毓金(1966～)，男，博士，教授，研究方向：骨疾病相关机制研究，E-mail：tangyujin196709@163.com。

通信作者：廖品琥(1967～)，男，博士，教授，研究方向：恶性肿瘤的临床分子诊断研究，E-mail：liaopinhu@163.com。

R 349.6

A

0253-4304(2016)07-0897-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.07.01

2016-02-21

2016-05-20)