呼吸道感染婴幼儿肺炎链球菌的耐药性及青霉素结合蛋白基因突变分析▲

孔 山 忽胜和 杨新原 赵卫东

(大理大学1 临床医学院检验诊断学教研室，2 附属医院检验科，大理市 671000，E-mail：185354177@qq.com)

论著·临床研究

呼吸道感染婴幼儿肺炎链球菌的耐药性及青霉素结合蛋白基因突变分析▲

孔 山1忽胜和2杨新原2赵卫东1

(大理大学1 临床医学院检验诊断学教研室，2 附属医院检验科，大理市 671000，E-mail：185354177@qq.com)

目的 分析呼吸道感染婴幼儿肺炎链球菌的耐药性及青霉素结合蛋白基因(PBPs)突变情况。方法 收集呼吸道感染婴幼儿痰或咽拭子标本中分离出的24株肺炎链球菌，进行菌株鉴定和药敏试验。对筛选出的耐青霉素肺炎链球菌行耐药性分析，并提取菌株DNA后分析PBPs基因突变情况。结果 24株肺炎链球菌中，青霉素不敏感菌株有13株，占54.2%；13株青霉素不敏感菌株对对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸和头孢呋辛不敏感率较高，分别为100%、76.9%和76.9%；对头孢噻肟、头孢曲松和头孢吡肟的不敏感率较低，分别为46.2%、38.5%和30.8%；对美罗培南和万古霉素的不敏感率最低，分别为15.4%和0。13株青霉素不敏感菌株未发现pbp1a基因突变菌株，5株存在pbp2b基因突变，占38.5%。结论 青霉素不敏感肺炎链球菌存在对多种抗生素耐药情况，而pbp2b基因突变可能是导致肺炎链球菌耐药的重要原因，应加强肺炎链球菌耐药性及PBP基因突变监测。

肺炎链球菌；青霉素；青霉素结合蛋白；耐药性

肺炎链球菌在人群中可以引起中耳炎、大叶性肺炎和脑膜炎等感染性疾病，尤其是在婴幼儿中[1]。青霉素自面世以来被广泛应用于治疗肺炎链球菌肺炎。自20世纪60年代耐青霉素肺炎链球菌(penicillin resistantStreptococcuspneumoniae，PRSP)出现，耐药菌株的流行与扩散对青霉素的临床治疗有效率造成很大影响。更为严重的是，对青霉素耐药的菌株会对其他β-内酰胺类药物造成交叉耐药。青霉素结合蛋白(penicillin-binding proteins，PBPs)编码pbp基因突变是导致PRSP的主要原因[2]。为了解婴幼儿患者肺炎链球菌pbps基因突变与抗生素耐药之间的关系，笔者对24株分离自婴幼儿(≤5岁)的肺炎链球菌进行研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2013年3月至2014年10月大理大学大理附属医院送检的呼吸道感染婴幼儿的痰或咽拭子标本中分离肺炎链球菌27株，其中有3株在保存过程中死亡，剩余24株。

1.2 菌株分离、鉴定与保存 无菌采集标本1.5 h内即接种于哥伦比亚血琼脂平板(生物梅里埃公司，批号43041)，置含5% CO2的培养箱中37℃孵育24～48 h，根据菌落特征，革兰染色后显微镜下观察形态，行奥普托欣敏感试验进行鉴别，再用全自动微生物鉴定仪(VITEK-2 Compact)(法国生物梅里埃公司)进行鉴定。挑取纯化后的肺炎链球菌菌落至含30%甘油的脑心浸液肉汤(青岛海博生物公司，批号HB8297-1)中，-80℃冷冻保存。

1.3 药敏试验 将保存的菌株从-80℃中取出，置于37℃水浴锅中约3 min，迅速解冻，然后将菌液接种于哥伦比亚血琼脂平板复苏细菌备用。用苯唑西林K-B纸片扩散法进行青霉素敏感试验，折点按美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI)M2-A11标准[3]；采用微量肉汤稀释法，按照CLSI M7-A9标准中非脑膜炎折点对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟、美罗培南和万古霉素等8种常用抗生素进行药敏试验。质控菌株为肺炎链球菌ATCC 49619(购自上海乐讯生物科技公司)。

1.4 菌株DNA的提取 将保存于-80℃的菌株取出，至37℃水浴中2 min，快速解冻，加到脑心浸液肉汤中，置于5% CO2、37℃震荡培养箱中摇菌18 h，用细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司，DP302)，按照说明书步骤提取肺炎链球菌DNA。

1.5 PBPs基因PCR扩增 用2×Taq PCR MasterMix 试剂盒(北京天根生化科技有限公司，KT201)进行PCR。以提取的肺炎链球菌DNA为模板进行PCR扩增，pbp基因引物序列及实验参数如下：(1)pbp1a-F：5′-3′ GAA CTT CAA GAC AAG GCA GT，pbp1a-R：5′-3′ GTA AAC ACA AGC CAA GAC AC；热循环参数为：94℃预变性3 min，然后94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，最后72℃延长5 min，共35个循环，产物1.4 kb。(2)pbp2b-F：5′-3′ GAT CCT CTA AAT GAT TCT CAG GTG G，pbp2b-R：5′-3′ CCA TTA GCT TAG CAA TAG GTG TTG G；热循环参数为：94℃预变性3 min，然后94℃ 1 min，55℃ 2 min，72℃ 2 min，最后72℃延长5 min，共30个循环，产物1.5 kb。

1.6 PCR产物电泳及测序 PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，DNA分子量标准Marker V，包含6个条带，分别为200、400、700、1 000、1 500、2 000 bp(北京天根生化科技有限公司，MD105)。PCR产物送至铂尚生物技术(上海)公司进行测序，所得序列在GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)使用BLAST软件与青霉素敏感肺炎链球菌R6(基因登录号：NC-003098)进行序列比对分析[4]。

2 结 果

2.1 青霉素敏感试验 24株肺炎链球菌中，对苯唑西林敏感菌11株，占45.8%；中度敏感菌株10株，占41.7%；耐药菌3株，占12.5%；不敏感率为54.2%(13/24)。

2.2 药敏试验结果 13株PRSP对8种常用抗生素的耐药结果显示，PRSP对氨苄西林的耐药率最高，其次为阿莫西林/克拉维酸钾、头孢呋辛，对万古霉素均敏感，见表1。

表1 13株青霉素不敏感PRSP对常用抗生素的药敏情况(株，%)

2.3 PRSP基因分型 青霉素耐药及中度敏感的13株PRSP中，全部扩增出了pbp1a基因和pbp2b基因，将测序结果与R6标准菌株序列对比发现，有5株存在pbp2b基因突变，占38.5%(5/13)，其中3株耐青霉素肺炎链球菌的pbp2b基因全部存在突变位点，占100%(3/3)，未发现pbp1a基因突变菌株。存在pbp2b基因的突变株PBP基因PCR产物电泳结果见图1、图2。

图1 pbp1a基因型代表菌株PCR产物电泳结果

注：M代表DNA Marker，N为阴性对照，2、5、6、7、10分别表示第2、5、6、7、10号菌株。

图2 pbp2b基因型代表菌株PCR产物电泳结果

注：M代表DNA Marker，N为阴性对照，2、5、6、7、10分别表示第2、5、6、7、10号菌株。

2.4pbp2b基因氨基酸序列比对 有青霉素耐药菌的PBP2b氨基酸序列都存在SSN(保守序列)附近变异，为T→A(苏氨酸→丙氨酸)，pbp2b基因氨基酸序列比对结果见表2。

表2 5株pbp2b基因变异肺炎链球菌氨基酸序列与R6标准菌序列对比结果

3 讨 论

肺炎链球菌是一种常见的造成机会致病的阳性球菌，主要寄居于人体鼻咽部，婴幼儿是该菌的主要易感人群[1]。感染该菌后常会导致儿童肺炎及脑膜炎等疾病。青霉素是治疗肺炎链球菌感染的首选药物。目前，国内外关于耐青霉素肺炎链球菌的文献报告日益增多。一项包括欧洲和南美多个临床中心的数据表明，在儿科患者人青霉素耐药率为35%～86%[5]。我国一项包括12所教学医院的数据表明，2005年至2010年间，青霉素耐药菌株从28.6%增加至59.5%，而在5岁以下儿童患者中，青霉素耐药株的分离率为70.6%[6]。崔建邦等[7]报告重庆儿童肺炎链球菌青霉素耐药率为3.32%，不敏感率为47.30%。本实验中，肺炎链球菌青霉素耐药率为12.5%，不敏感率为54.2%。以上肺炎链球菌耐药率不相同可能与不同地区用药习惯有关。

本研究13株PRSP对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸和头孢呋辛耐药率较高，分别为61.5%、46.2%和38.5%，不敏感率分别为100.0%、76.9%和76.9%，因此，这些药物用于肺炎链球菌肺炎治疗时应慎重选择；对头孢噻肟、头孢曲松和头孢吡肟的耐药率相对较低，均为15.4%，但是不敏感率分别为46.2%、38.5%和30.8%，提示应密切监测以避免不敏感菌株的增加；对美罗培南和万古霉素的敏感性高，分别为86.4%和100.0%，说明这两种抗生素对肺炎链球菌的抗菌能力较强。

近年来，研究发现β-内酰胺类抗生素通过与PBPs中的丝氨酸亲核基团结合，生成较稳定的酰胺酶中间产物，以此来抑制细菌增殖[8]。PBPs主要包括6个亚单位，分别为PBP1a、PBP1b、PBP2a、PBP2b、PBP2x、PBP3[9]。其中PBP1a突变与高水平的耐药有关[10]，而PBP2b突变与低水平耐药有关，而肺炎链球菌对青霉素的耐药主要是由于PBP2b基因的突变导致与青霉素亲和力下降所引起[11]。本研究结果显示，在13株PRSP中，均扩增出了pbp1a基因和pbp2b基因，通过与不耐青霉素的肺炎链球菌R6序列对比发现，pbp1a基因未发现突变，可能是由于收集的菌株较少造成的；而pbp2b基因突变在3株耐药株中都存在，在2株对青霉素中度敏感菌株中存在。与其他研究结果[12]类似的是，所有青霉素耐药菌的PBP2b氨基酸序列都存在SSN(保守序列)附近变异，为T→A(苏氨酸→丙氨酸)，提示pbp2b基因突变可能是造成肺炎链球菌对青霉素及其他β-内酰胺类抗生素耐药的重要原因。

综上所述，肺炎链球菌耐药性问题严峻，尤其是不敏感菌株的比例较大，应该加强日常PRSP耐药性以及对耐药基因突变的监测，及时掌握PRSP的耐药趋势及耐药基因突变情况，同时加强与临床医师沟通，共同控制肺炎链球菌耐药株的产生与流行。

[1] Yao KH,Yang YH.Streptococcus pneumoniae diseases in Chinese children:past,present and future[J].Vaccine,2008,26(35):4 425-4 433.

[2] Zapun A,Contreras-Martel C,Vernet T.Penicillin-binding proteins and beta-lactam resistance[J].FEMS Microbiol Rev,2008,32(2):361-385.

[3] Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard-Eleventh Edition.CLSI document M02-A11 [M].Wayne,PA.2012:26-28.

[4] Hoskins J,Alborn WE Jr,Arnold J,et al.Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6[J].J Bacteriol,2001,183(19):5 709-5 717.

[5] Brandon M,Dowzicky MJ.Antimicrobial susceptibility among Gram-positive organisms collected from pediatric patients globally between 2004 and 2011:results from the Tigecycline Evaluation and Surveillance Trial[J].J Clin Microbiol,2013,51(7):2 371-2 378.

[6] Zhao C,Sun H,Wang H,et al.Antimicrobial resistance trends among 5 608 clinical Gram-positive isolates in China:results from the Gram-Positive Cocci Resistance Surveillance program(2005-2010)[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2012,73(2):174-181.

[7] 崔建邦,郑玉强,景春梅,等.241例重庆地区急性呼吸道感染患儿肺炎链球菌耐药性分析[J].重庆医科大学学报,2015,40(3):459-462.

[8] Hakenbeck R,Brückner R,Denapaite D,et al.Molecular mechanisms of β-lactam resistance in Streptococcus pneumoniae [J].Future Microbiol,2012,7(3):395-410.

[9] Albarracin Orio AG,Pias GE,Cortes PR,et al.Compensatory evolution of pbp mutations restores the fitness cost imposed by beta-lactam resistance in Streptococcus pneumoniae[J].PLoS Pathog,2011,7(2):e1002000.

[10]Leach AJ,Morris PS,Smith-Vaughan H,et al.In vivo penicillin MIC drift to extremely high resistance in Serotype 14 Streptococcus pneumoniae persistently colonizing the nasopharynx of an infant with chronic suppurative lung disease:a case study[J].Antimicrob Agents Chemother,2002,46(11):3 648-3 649.

[11]Sadeghi J,Ahamadi A,Douraghi M,et al.Molecular analysis ofpbp2bin Streptococcus pneumonia isolated from clinical and normal flora samples[J].Curr Microbiol,2015,70(2):206-211.

[12]张春玲,许亚亚,牛 津,等.耐β-内酰胺类抗生素肺炎链球菌青霉素结合蛋白PBPs的氨基酸基因变异[J].中国微生态学杂志,2012,24(12):1 088-1 092.

Drug resistance and mutation of penicillin-binding proteins gene ofStreptococcuspneumoniaein children with respiratory infection

KONGShan1,HUSheng-he2,YANGXin-yuan2,ZHAOWei-dong1

(1DepartmentofLaboratoryDiagnostics,ClinicalMedicineCollege,DaliUniversity,Dali671000,China; 2DepartmentofClinicalLaboratory,theAffiliatedHospitalofDaliUniversity,Dali671000,China)

Objective To analyze the drug resistance and mutation of penicillin-binding proteins(PBPs) gene ofStreptococcuspneumoniae(S.pneumoniae) in children with respiratory infection.Methods Twenty-four strains ofS.pneumoniaewere obtained from sputum or throat swab of children with respiratory infection for the identification of bacterial strain and drug sensitive test.Then the drug resistance was analyzed in the screened penicillin resistantStreptococcuspneumonia(PRSP),and DNA was extracted from these strains to analyze the mutation of PBPs gene.Results Among 24 strains ofS.pneumoniae,13(54.2%) strains were PRSP.The unsensitive rates of the 13 strains of PRSP to ampicillin,amoxicillin-clavulanic acid and cefuroxime were quite high,were 100%,76.9% and 76.9% respectively.The unsensitive rates of PRSP to cefotaxime,ceftriaxone and cefepime were low,were 46.2%,38.5% and 30.8% respectively.And the unsensitive rates of PRSP to meropenem and vancomycin were the lowest,were 15.4% and 0 respectively.Among 13 strains of PRSP,nopbp1amutation strain was found,and 5pbp2bmutation strains were found,accounting for 38.5%.Conclusion PRSP is resistant to multiple antibiotics,andpbp2bmutation may be an important factor that causesS.pneumoniaeto be drug resistant.The monitoring for drug-resistance and PBPs gene mutation ofS.pneumoniashould be strengthened.

Streptococcuspneumoniae,Penicillin resistantStreptococcuspneumonia,Penicillin-binding protein; Drug resistance

云南省科技厅应用基础研究青年项目(2013FD095)

孔山(1972～)，男，在职研究生，讲师，研究方向：临床检验诊断学。

赵卫东(1983～)，男，在读博士研究生，助教，研究方向：临床病原微生物，E-mail：wdzhao1229@foxmail.com。

R 378.14

A

0253-4304(2016)05-0632-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.05.09

2016-01-20

2016-04-07)