血管平滑肌细胞在血管中膜钙化中的作用研究进展

罗智环　陈　俊　闵新文湖北医药学院附属东风医院心内科，湖北十堰　442000

血管平滑肌细胞在血管中膜钙化中的作用研究进展

罗智环陈俊闵新文
湖北医药学院附属东风医院心内科，湖北十堰442000

近年动脉钙化（VCs）的研究比较广泛，人们对动脉钙化的认识也有了进一步的提升，明确其是一种通过多种分子信号通路启动和调节的主动过程。在动脉中膜钙化过程中，血管平滑肌细胞（VSMCs）在钙化的启动、进展及调节中发挥了重要作用，本文回顾了血管平滑肌细胞在血管中膜钙化中的相关作用研究，并指出平滑肌细胞转分化为骨样细胞的动力研究以及如何通过控制平滑肌细胞的骨转化来逆转钙化将是未来可能的研究方向。

中膜钙化；平滑肌细胞；转录因子；基质囊泡；钙化调节

血管钙化是一种伴随着羟基磷灰石结晶在细胞外基质和动脉壁细胞上蓄积的病理过程，是动脉粥样硬化、高血压、糖尿病血管病变的共同病理表现。现已明确血管钙化是一种通过多种分子信号通路启动和调节的主动过程，根据钙化在血管发生部位的不同，将其分为内膜钙化和中膜钙化，内膜钙化的钙化部位与粥样硬化斑块一致，呈点灶状或斑片状；中膜钙化的钙化灶则沿着血管中膜和内弹性膜呈线状蓄积，病变常常定位于与弹性层紧密联系的圆周[1]。研究发现，内膜钙化常与动脉粥样硬化相关，其发生发展很大程度上与脂蛋白和细胞因子参与的炎性级联反应有关；中膜钙化则与全身或局部的钙磷酸盐代谢紊乱、糖代谢紊乱以及弹力蛋白变性有关。

在此过程中，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）通过成骨相关基因的表达决定并调节VSMCs转化为骨样细胞，VSMCs释放的基质囊泡以及凋亡后产生的凋亡小体启动钙化过程，miRNA、钙化相关蛋白、促钙化物质则在VSMCs骨化过程中发挥重要的调节作用。本文将重点回顾已知的血管平滑肌细胞在血管中膜钙化中所发挥的作用以及未来可能的研究方向。

1　成骨相关转录因子的表达决定并调节VSMCs转化为骨样细胞

在血管壁中，VSMCs表现出了分化成骨样细胞的潜能，并且在这一过程中发挥了重要的调节作用。在钙化的血管壁，骨相关转录因子如Msx2、Runx2（也称为Cbfa1）、Osterix和Sox9等的表达决定了细胞分化为成骨细胞[2-3]。促骨化因子如骨形态蛋白（BMP）和炎性介质如肿瘤坏死因子α（TNF-α）能激活Msx2和Wnt信号通路，Msx2可通过上调Wnt3a、Wnt7a和碱性磷酸酶来促进钙化[3-4]。Msx2和Wnt信号通路还可以上调转录因子Runx2和osterix的表达，相应的使得骨相关蛋白如骨钙素、骨硬化蛋白以及RANKL受体激活剂的表达增加[3，5]。Runx2的下游信号Osterix则可以使骨涎蛋白和碱性磷酸酶等其他骨相关蛋白的表达量增加[6]。

血管平滑肌细胞分化成骨样细胞并表达成骨相关转录因子和成骨相关蛋白的能力已经在体内和体外实验中得到证实。模拟慢性肾脏疾病患者，将VSMCs暴露于可促钙化的磷酸盐水平，发现平滑肌细胞可收缩蛋白SM22α和SMα-actin水平降低，而成骨标志物Runx2、骨桥蛋白、骨钙蛋白和碱性磷酸酶水平升高[7]。最终证实SMCs在体内遵循这一过程的实验是对基质Gla蛋白（MGP）基因敲除小鼠的谱系追踪研究，这类小鼠因为缺乏钙化抑制因子MGP所以在早期就表现出了严重的血管钙化。在这个研究中，心肌素（myocardio）的下调及Msx2表达的增高被证明是发生在血管钙化之前。这就证明了是Msx2而不是其下游信号或者成骨相关蛋白导致了VSMCs发生了成骨样改变，与此同时，该实验也证实了是VSMCs而不是骨髓来源的间充质干细胞在血管钙化中发生作用[8]。

2　凋亡小体和基质囊泡的产生启动VSMCs的钙化过程

在一般情况下，生物矿化被认定为组织表达I型胶原和碱性磷酸酶，这些蛋白的共表达足以引起异位钙化。I型胶原和碱性磷酸酶在钙化动脉粥样硬化斑块中与矿物沉积分布部位相同，并且这两种物质可以通过血管细胞体外培养而产生[9]。中膜钙化常与弹性蛋白而非I型胶原蛋白有关。在钙化早期阶段，晶体形成源于外膜囊泡，如基质小泡或凋亡小体，它们为钙化的发生提供了一个高钙、高磷的微观环境以及具有膜结合能力的碱性磷酸酶[10]。

血管壁内形成的磷酸钙晶体被VSMCs內吞后，在溶酶体的作用下降解，使得细胞内钙离子浓度升高，高钙环境可以诱导平滑肌细胞死亡，并产生凋亡小体；VSMCs也通过形成细胞外囊泡参与磷酸钙晶体成核的过程。这些基质囊泡是由受损的活的或即将死亡的VSMCs中的巨噬细胞和血管平滑肌细胞释放的。这些基质囊泡含有碱性磷酸酶活性，并含有大量的钙和磷，形成易于碱性钙磷沉积的微环境。除此之外，在SMC源性的基质小泡内还包含已确定的79种蛋白质，包括与钙化相关的蛋白质、细胞外基质蛋白和钙通道蛋白，基质的生物合成、运输及细胞骨架蛋白，氧化和内质网应激相关蛋白以及其他血清蛋白[11]。

由血管平滑肌细胞释放的基质囊泡以及降解产生的凋亡小体可作为晶体在主动脉壁沉积的成核剂。血管平滑肌细胞凋亡还与钙化和中膜变性有关。通过电子显微镜可观察到这种结晶基质囊泡在钙化斑块内往往很接近凋亡的平滑肌细胞，并且，当其分离后仍保留集中钙与磷酸盐以及启动新晶体形成的能力。基质小泡可能是用于胞内通讯的胞膜囊泡的某种特定形式，而凋亡小体可能是这一病理生理过程中物质的代表[11-12]。

3　VSMCs钙化的调控因子

VSMCs钙化相关的调控因子主要与发育、炎症和代谢等因素相关。其中促进血管钙化的调控因子有高磷、维生素D（Vitamin D，VD）、骨形态发生蛋白（BMP）、肿瘤坏死因子（TNF）、氧化应激等。钙化的抑制因子主要有微小RNA、基质Gla蛋白和胎球蛋白A等。

3.1促进因子

3.1.1高磷除了化学因素促进晶体形成外，高磷血症在体外可以增加平滑肌细胞骨软骨化基因表达。在生理浓度的磷酸盐（＜1 mmol/L Pi）条件下，钙化只有在特定基因表达的条件下或者在长期暴露在危险因素的情况下才会发生。在高磷酸血症条件下（＞2 mmol/L Pi），磷酸盐的沉积非常迅速且很容易被观察到[13]。血清磷酸盐水平通过磷酸本身来进行调节，甲状旁腺激素，和VD，以及成纤维细胞生长因子23，这些是从骨细胞中释放并通过激活其在肾脏的共受体Klotho，来控制磷酸盐的消除[14]。

3.1.2维生素D高剂量的膳食VD可以诱导中膜钙化；这经常被用于制作血管钙化动物模型[14]。通过紫外线照射产生的VD与其结合蛋白结合后存在于机体循环系统，膳食VD经由乳糜微粒及脂蛋白颗粒的流通被运送到循环系统。当脂蛋白颗粒在动脉粥样硬化斑块沉积时，它们携带的VD可能被血管平滑肌细胞、单核细胞和巨噬细胞表达的1-α-羟化酶转化为活性形式。这预示着潜在的VD可以促进动脉粥样硬化钙化以及心血管风险发生的时间。流行病学显示，VD无论是过量还是不足均可以增加心血管危险因素的发生率[15]。

3.1.3骨形态发生蛋白（BMP）BMP2和BMP4是从牛骨中分离的有效的成骨分化相关因子，它们可以在体内诱导肌肉组织的异位骨化以及在体外诱导平滑肌细胞的矿化。BMP2是通过Runx2来发挥作用的，它可以诱导I型胶原和碱性磷酸酶的表达[16]。BMP2可以被noggin、chordin和MGP（基质 Gla蛋白）拮抗[17]。BMP4在大鼠平滑肌细胞内被肿瘤坏死因子配体超家族成员11（也被誉为核因子κB-B配体或RANKL的受体激活剂）诱发[18]。

3.1.4肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子诱导 Msx2的Wnt-β-catenin信号通路，这样会加剧氧化应激和高磷血症[19]。TNF在体外还通过降低抗凋亡的Gas6的表达，以及通过蛋白激酶A信号诱导碱性磷酸酶活化促进钙化[20]。TNF也可通过NADPH介导活性氧的产生和诱导Msx2的表达作用于碱性磷酸酶[21]。在体内，平滑肌细胞靶向肿瘤坏死因子的过度表达增强了Msx2-Wnt信号诱导LDL-受体敲除小鼠钙化的程度，临床上常使用TNF的单克隆抗体-英夫利昔单抗来抑制这些小鼠Wnt信号的激活和钙化[21]。

3.1.5氧化应激氧化应激是促进血管细胞钙化的独立因子，并且可以解释炎性细胞因子、氧化脂质和某些氧固醇的促钙化效应。过氧化氢通过上调Runx2促进血管平滑肌细胞的骨软骨化过程。活性氧的水平在人体瓣膜钙化位点是增加的[22]。脂质氧化的产物，如最低限度修饰的LDL和氧化磷脂，诱导成骨和细胞凋亡介导的血管细胞的钙化。TNF和过氧化氢诱导的成骨分化是由胰岛素样生长因子1抑制[23]。

氧化应激还可以激活内质网应激，内质网应激是另外一种促进平滑肌细胞转分化为成骨细胞的机制，在人体的SMC中，骨形态蛋白-2可以通过增强NADPH氧化酶的活性以及产生活性氧来激活内质网应激[24]。内质网应激可以激活转化因子XBP-1的表达，XBP-1常与Runx2的启动子结合，启动VSMCs的骨转化；在主动脉钙化实验模型中，内质网应激蛋白可以活化转录因子4（ATF4），从而促进平滑肌细胞钙化[25]。

3.2抑制因子

3.2.1微小RNA（mi RNAs）微小RNA（miRs）通过在促钙化的条件下调节基因的表达，已经成为SMCs分化为成骨细胞的关键调节因子。例如，在钙化情况下，miR-143/145可以调节SMC分化标志物的表达并下调Kruppel样因子4的表达。其他的研究表明，平滑肌细胞中miR-204、miR-205、miR-133a或miR-30b的表达减少发生在钙化和Runx2的表达上调之前[26]。将平滑肌细胞暴露于促成骨介质21 d后，靶基因为ETS1和Osterix的miRNA-125b发生了明显下调[27].

3.2.2基质Gl a蛋白（MGP）MGP是一个BMP抑制剂。MGP在钙化患者动脉中的表达远高于在正常人动脉的表达。这种蛋白在血管钙化中具有抑制作用的揭示源自于意想不到的关于MGP缺陷小鼠表型的研究，MGP缺陷小鼠的主动脉壁以及大分支血管完全发生软骨化[28]。后来的研究表明MGP抑制钙化的机制主要有两种：直接结合新生晶体，以及直接绑定和抑制BMP2；反过来，MGP可以被热休克蛋白70以及缺乏维生素K所抑制[29]。MGP发挥功能取决于维生素K依赖性γ羧化谷氨酸残基，这一过程可被华法林抑制。因此，长期华法林治疗与股动脉钙化风险增加相关，华法林疗法与其他类型的血管钙化的联系正在研究中。

3.2.3胎球蛋白A胎球蛋白A是一种在肝脏中大量产生的血清蛋白，结合并和磷酸钙纳米晶体形成络合物，从而形成钙化蛋白颗粒。它还可以阻止磷酸钙聚集形成不溶性矿物晶体从而抑制其进一步的增长。除此之外，胎球蛋白A也促进细胞吸收和清除这一络合物[30]。研究者发现胎球蛋白主要在血管钙化位点积聚。在体外，由血管平滑肌细胞摄取胎球蛋白A从而减少其基质小泡钙化的能力[30]。低水平的胎球蛋白A与血管钙化现象的增加和慢性肾脏疾病患者的死亡相关[31]。

4　总结与展望

综上所述，血管平滑肌细胞在中膜钙化的启动调节过程中发挥了重要作用，尤其是其转分化为骨样细胞的能力尤应引起研究人员的注意，现阶段虽已阐明部分VSMCs分化为骨样细胞的机制，但其转分化的动力尚未阐明，VSMCs钙化的主要监管机制的阐明及如何从二级现象来区分它们是现在迫切需要得到解决的问题。在同样的条件下，为什么有些VSMCs会发生凋亡而有些细胞只发生了基因表达的改变？究竟什么样的特定条件决定了血管壁细胞会发生凋亡、坏死以及其他形式的细胞死亡呢？骨相关基因的表达究竟是VCm的原因还是结果？这些依旧是不清楚的。因此把研究的关注点放在VCm的早期阶段是非常重要的，如何通过调节VSMCs成骨基因的表达从而逆转血管钙化将是未来研究的热点。

[1]Stary HC.Naturalhistory of calcium deposits in atherosclerosis progression and regression[J].Z Kardiol，2000，89 Suppl 2：28-35.

[2]Bostrom KI，Rajamannan NM，Towler DA.The regulation of valvular and vascularsclerosis by osteogenic morphogens[J]. Circ Res，2011，109（5）：564-577.

[3]Kobayashi Y，Uehara S，Koide M，et al.The regulation of osteoclast differentiation by Wnt signals[J].BoneKEy reports，2015，4：713.

[4]Shao JS，Cheng SL，Pingsterhaus JM，et al.Msx2 promotes cardiovascular calcification by activating paracrine Wnt signals[J].J Clin Invest，2005，115（5）：1210-1220.

[5]Sun S，Wang Z，Hao Y.Osterix overexpression enhances osteoblast differentiation ofmuscle satellite cells in vitro[J]. Int J Oral Maxillofac Surg，2008，37（4）：350-356.

[6]Zhu F，Friedman MS，Luo W，et al.The transcription factor osterix（SP7）regulates BMP6-induced human osteoblast differentiation[J].J Cell Physiol，2012，227（6）：2677-2685.

[7]Steitz SA，Speer MY，Curinga G，et al.Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification：upregulation of Cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers[J].Circ Res，2001，89（12）：1147-1154.

[8]Speer MY，Yang HY，Brabb T，et al.Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondro-cytes in calcifying arteries[J].Circ Res，2009，104（6）：733-741.

[9]Murshed M，Harmey D，Millan JL，et al.Unique coexpression in osteoblasts of broadly expressed genes accounts for the spatial restriction of ECM mineralization to bone[J]. Genes Dev，2005，19（9）：1093-1104.

[10]Harmey D，Hessle L，Narisawa S，et al.Concerted regulation of inorganic pyrophosphate and osteopontin by akp2，enpp1，and ank：an integrated model of the pathogenesis of mineralization disorders[J].Am J Pathol，2004，164（4）：1199-1209.

[11]De Broe M.Calcium regulates key components of vascular smooth muscle cell-derived matrix vesicles to enhance mineralization[J].Kidney Int，2011，80（8）：791-792.

[12]Clarke MC，Littlewood TD，Figg N，et al.Chronic apoptosis ofvascularsmoothmusclecellsaccelerates atherosclerosis and promotes calcification and medial degeneration[J].Circ Res，2008，102（12）：1529-1538.

[13]Yao L，Sun YT，Sun W，et al.High phosphorus level leads to aortic calcification via beta-catenin in chronic kidney disease[J].Am J Nephrol，2015，41（1）：28-36.

[14]Memon F，El-Abbadi M，Nakatani T，et al.Does Fgf23-klotho activity influence vascular and soft tissue calcification through regulating mineral ion metabolism?[J]. Kidney Int，2008，74（5）：566-570.

[15]Sanket S，Madireddi J，Stanley W，et al.Relation between Vitamin D deficiency and severity of chronic obstructive pulmonary disease-a case control study[J].Journal of clinical and diagnostic research：JCDR，2016，10（1）：Oc16-Oc9.

[16]Li X，Yang HY，Giachelli CM.BMP-2 promotes phosphate uptake，phenotypic modulation，and calcification of human vascular smooth muscle cells[J].Atherosclerosis，2008，199（2）：271-277.

[17]Zebboudj AF，Imura M，Bostrom K.Matrix GLA protein，a regulatory protein for bone morphogenetic protein-2[J]. J Biol Chem，2002，277（6）：4388-4394.

[18]Panizo S，Cardus A，Encinas M，et al.RANKL increases vascular smooth muscle cell calcification through a RANK-BMP4-dependent pathway[J].Circ Res，2009，104（9）：1041-1048.

[19]Al-Aly Z，Shao JS，Lai CF，et al.Aortic Msx2-Wnt calcification cascade is regulated by TNF-alpha-dependent signals in diabetic Ldlr-/-mice[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27（12）：2589-2596.

[20]Lau WL，Linnes M，Chu EY，et al.High phosphate feeding promotes mineral and bone abnormalities in mice with chronic kidney disease[J].Nephrol Dial Transplant，2013，28（1）：62-69.

[21]Son BK，Akishita M，Iijima K，et al.Adiponectin antagonizes stimulatory effect of tumor necrosis factor-alpha on vascular smooth muscle cell calcification：regulation of growth arrest-specific gene 6-mediated survival pathway by adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase[J]. Endocrinology，2008，149（4）：1646-1653.

[22]Byon CH，Javed A，Dai Q，et al.Oxidative stress induces vascular calcification through modulation of the osteogenic transcription factor Runx2 by AKT signaling[J]. J Biol Chem，2008，283（22）：15319-15327.

[23]Radcliff K，Tang TB，Lim J，et al.Insulin-like growth factor-I regulates proliferation and osteoblastic differentiation of calcifying vascular cells via extracellular signal-regulated protein kinase and phosphatidylinositol 3-kinase pathways[J].Circ Res，2005，96（4）：398-400.

[24]Liberman M，Johnson RC，Handy DE，et al.Bone morphogenetic protein-2 activates NADPH oxidase to increase endoplasmic reticulum stress and human coronary artery smooth muscle cell calcification[J].Biochem Biophys Res Commun，2011，413（3）：436-441.

[25]Duan XH，Chang JR，Zhang J，et al.Activating transcription factor 4 is involved in endoplasmic reticulum stressmediated apoptosis contributing to vascular calcification[J]. Apoptosis，2013，18（9）：1132-1144.

[26]Goettsch C，Hutcheson JD，Aikawa E.MicroRNA in cardiovascular calcification：focus on targets and extracellular vesicle delivery mechanisms[J].Circ Res，2013，112（7）：1073-1084.

[27]Wen P，Cao H，Fang L，et al.miR-125b/Ets1 axis regulates transdifferentiation andcalcification of vascular smooth muscle cells in a high-phosphate environment[J]. Exp Cell Res，2014，322（2）：302-312.

[28]Luo G，Ducy P，McKee MD，et al.Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein[J].Nature，1997，386（6620）：78-81.

[29]Yao Y，Watson AD，Ji S，et al.Heat shock protein 70 enhances vascular bone morphogenetic protein-4 signaling by binding matrix Gla protein[J].Circ Res，2009，105（6）：575-584.

[30]Heiss A，Eckert T，Aretz A，et al.Hierarchical role of fetuin-A and acidic serum proteins in the formation and stabilization of calcium phosphate particles[J].The Journal of biological chemistry，2008，283（21）：14815-14825.

[31]Ketteler M，Bongartz P，Westenfeld R，et al.Association of low fetuin-A（AHSG）concentrations in serum with cardiovascular mortality in patients on dialysis：a crosssectional study[J].Lancet（London，England），2003，361（9360）：827-833.

Research progress of effect of vascular smooth muscle cell in medial vascular calcification

LUO ZhihuanCHEN JunMIN Xinwen
Department of Cardiology,Dongfeng Hosptial of Hubei University of Medicine,Hubei Province,Shiyan442000,China

In recent years,vascular calcification（VCs）is widely researched.People's understanding of arterial calcification has also been further improved,recent studies illustrate that VC is an active process initiated and regulated via a variety of molecular signalling pathways.In the process of arterial medial calcification,vascular smooth muscle cells (VSMCs)played an important role in the initiate,development and regulation of vascular calcification.This report will review the effect of vascular smooth muscle cell in medial vascular calcification and propose that the original power of VSMCs transformed into an osteo-chondrogenic phenotype and how to reverse calcification through regulating VSMCs trans-differentiate will be the research direction in the future.

Medial calcification;Smooth muscle cell;Transcription factor;Matrix vesicle;Calcium regulation

R714.252

A

1673-7210（2016）04（b）-0031-04

国家自然科学基金资助项目（81400288）；湖北省自然科学基金资助项目（2012FFA052）。

罗智环（1991.9-），女，湖北医药学院心血管内科专业2014级在读硕士研究生；研究方向：动脉钙化。

闵新文（1969.11-），男，博士，主任医师；研究方向：冠心病和高血压的临床和基础研究。

（2015-12-21本文编辑：赵鲁枫）