维生素E对皮瓣缺血再灌注损伤的保护作用

仝瑞兵徐勇董乐乐

维生素E对皮瓣缺血再灌注损伤的保护作用

仝瑞兵①徐勇①董乐乐①

目的：观察维生素E对大鼠腹壁浅血管皮瓣缺血再灌注损伤的保护作用。方法：利用雌性Wistar大鼠制作腹壁浅血管为蒂的缺血再灌注皮瓣模型并进行试验，将30只Wistar大鼠按随机数字表法分为假手术组、生理盐水组和维生素E组，每组10只。假手术组不做缺血再灌注处理，维生素E组术前1 h腹腔注射维生素E 100 mg/kg，生理盐水组术前1 h腹腔注射等体积生理盐水。生理盐水组和维生素E组于皮瓣缺血2 h再灌注1 h后、假手术组于术后3 h，均取皮瓣中段边缘全层皮瓣组织1 cm×1 cm，检测丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，光镜下观察病理组织变化。结果：生理盐水组MDA含量明显高于假手术组和维生素E组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；生理盐水组SOD活性明显低于假手术组和维生素E，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；假手术组未见明显组织创伤改变，生理盐水组皮瓣组织损伤较明显，而维生素E组明显好于生理盐水组。结论：维生素E具有抗氧自由基，减轻自由基的脂质过氧化作用，对缓解大鼠皮瓣的缺血再灌注损伤起着一定的保护作用。

维生素E； 皮瓣； 缺血再灌注损伤

First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College with Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010，China

随着现代化工业和交通运输业的快速发展，开放性创伤导致肢体大面积缺损的患者越来越多，对这类创面的治疗多采用游离皮瓣移植修复术，均取得一定的疗效，但术后皮瓣坏死时有发生，影响皮瓣成活率。研究发现缺血再灌注损伤是造成游离皮瓣移植术后坏死和慢性排异反应增加的主要原因之一［1］。因此，探讨皮瓣缺血再灌注损伤的发生机制，寻找更加安全有效的治疗方法是目前皮瓣外科领域研究的热点［2-4］。多数学者对维生素E治疗心、肝、肾及肠道等器官缺血再灌注损伤的研究较多，发现维生素E对缺血再灌注损伤具有一定的保护作用［5-7］；但维生素E是否对皮瓣缺血再灌注损伤也具有保护作用，尚未见相关报道。本实验通过将维生素E腹腔注射的方式作用于大鼠，观察其对大鼠腹部皮瓣缺血再灌注损伤的影响，为维生素E的临床应用提供实验和理论依据，现报道如下。

1　材料与方法

1.1材料与试剂 选用健康成年雌性Wistar大鼠30只，体重200～250 g，购自内蒙古大学实验动物中心。统一编号后采用随机数字表法随机分为假手术组、生理盐水组和维生素E组，每组10只。主要试剂：维生素E（购自Sigma公司，产品货号：47783，上海超研生物科技有限公司代理），超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒、丙二醛（MDA）检测试剂盒、考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒（购自南京建成生物工程研究所）。

1.2皮瓣设计与模型制备 根据Wistar大鼠腹壁浅动脉的解剖关系，在其右下腹部设计一个长方形皮瓣，大小为5 cm×3 cm，以腹壁浅血管为蒂。用10%的水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔内注射麻醉成功后将大鼠仰卧位固定在鼠台上，充分暴露腹部，备皮，用标记笔在大鼠右下腹皮肤上标记5 cm×3 cm大小矩形皮瓣标记线，按照Petry等［8］描述的方法进行皮瓣手术操作。沿标记线切开皮肤、皮下组织和肌膜层，在肌膜下层与肌肉层之间将皮瓣游离，仔细分离腹壁浅动静脉，在腹壁浅血管从股血管发出处用显微血管夹夹闭腹壁浅血管，形成皮瓣缺血再灌注模型。

1.3实验方法 假手术组：皮瓣造模后，不夹闭腹壁浅血管，皮瓣不做缺血再灌注处理；维生素E组：皮瓣造模后，用15 g显微血管夹在腹壁浅血管从股血管发出处夹闭腹壁浅血管，在术前1 h给予腹腔注射维生素E 100 mg/kg［9］；生理盐水组：皮瓣造模后，用15 g显微血管夹阻断腹壁浅血管，于术前1 h腹腔注射等体积生理盐水。假手术组于皮瓣造模3 h后取皮瓣中段边缘全层皮瓣组织1 cm×1 cm；生理盐水组和维生素E组在形成皮瓣缺血模型后，此时开始计时，2 h后将血管夹移除，制造再灌注模型，再灌注1 h后取皮瓣中段边缘全层皮瓣组织1 cm×1 cm，按照试剂盒的说明步骤测定所取组织中MDA含量，SOD活性及病理组织切片观察。最后将皮瓣原位缝合，碘伏消毒，术后石膏绷带固定大鼠腹部。

1.4观察指标 将取下的皮瓣组织平均分成2份，大小为0.5 cm×1 cm，一份用于MDA含量和SOD活力的测定，另一份放入10%的甲醛液中固定24 h，经脱水透明石蜡包埋切片后行HE染色，100倍光镜下观察病理组织学变化。

1.5统计学处理 使用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计学分析，计量资料以（）表示，使用单因素方差分析各组间MDA值和SOD值，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组术后3 h皮瓣组织MDA含量 生理盐水组术后3 h皮瓣组织MDA值为（29.2201±1.0036）nmol/g，高于假手术组的（10.6545±0.7957）nmol/g和维生素E组的（15.6379±0.8037）nmol/g，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.2各组术后3 h皮瓣组织SOD活性 生理盐水组术后3 h皮瓣组织活性为（32.4182±0.8428）U/mgprot，低于假手术组的（59.6048±1.0241）U/mgprot和维生素E组的（57.9427±1.1803）U/mgprot，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.3各组皮瓣病理组织学观察 假手术组未见明显组织创伤改变，结构排列正常；生理盐水组标本中可见皮下有大量出血，组织内毛细血管轻度瘀血，胶原纤维断裂明显，组织间有炎性细胞侵润，部分肌纤维变性，组织水肿；维生素E组仅可见组织间少量炎性细胞侵润，未见组织的明显破坏。

3　讨论

维生素E是生育酚类化合物的总称，是苯并二氢呋喃的衍生物，它能把自己氧化成生育醌，能使脂质过氧化自由基生成化学性质不活泼的脂质过氧化物，使脂类过氧化的连锁反应中断，从而有效抑制过氧化作用，保护细胞免受多不饱和脂肪酸（PUFA）氧化所产生的毒性物质的伤害［10］。维生素E能产生酚氧基，后者能够猝灭并能同单线态氧反应，这样就保护了PUFA不受单线态氧的氧化损伤，同时阴离子自由基和羟自由基还可以氧化酚氧基，使PUFA免受自由基攻击，从而有效地抑制脂肪酸的自动氧化。

目前，关于维生素E在多种组织器官缺血再灌注损伤中清除自由基保护组织细胞的研究有很多。Canbaz等［11］研究发现，维生素E对心脏缺血再灌注损伤有保护作用；翟健华等［12］通过动物实验研究证实心肌在缺血再灌注损伤时，自由基代谢异常，给予维生素E治疗后，通过提高超氧化物歧化酶（SOD）水平，降低丙二醛（MDA）含量，可减轻氧自由基对心肌组织的损伤和脂质过氧化作用，保护心肌组织；赵文波等［13］制作大鼠左半肝缺血再灌注模型，研究认为，维生素E对肝脏缺血再灌注损伤起保护作用；张伟等［14］通过对维生素E在青年和老年大鼠肾脏缺血再灌注损伤中的作用研究，认为维生素E可通过增加SOD水平，提高自由基清除能力，对大鼠肾脏缺血再灌注损伤起到保护作用。总之，维生素E是通过清除自由基和限制超氧化物及活性氧的生成水平而发挥其抗氧化作用的。皮瓣移植后局部组织缺血、缺氧，微循环障碍进而形成微血栓、白细胞介导的感染、氧自由基释放导致的氧化应激损伤等因素，导致皮瓣部分或全部坏死。血液循环障碍是皮瓣缺血坏死和缺血再灌注损伤的始动因素［15-16］。因此，血液循环的重建是皮瓣成活的基础，值得关注的是近年来的研究表明，皮瓣移植后的缺血、缺氧导致局部组织内环境紊乱、氧自由基产生增多及细胞内钙超载对皮瓣的损伤，也是影响皮瓣成活的重要因素［17-18］。

在本研究中，生理盐水组大鼠皮瓣缺血再灌注后MDA值为（29.2201±1.0036）nmol/g，明显高于假手术组，表明大鼠皮瓣缺血再灌注时组织中产生大量的氧自由基，它的化学性质非常活泼，氧化作用极强，能攻击脂质和生物膜与膜结构中的PUFA，引起强烈的毒性反应，从而损伤皮瓣组织，这种毒性反应的最大特点是以连锁反应的形式进行，维生素E可以进入组织细胞，具有抗自由基链式反应的作用［19-20］。同时大量氧自由基可引发脂质过氧化作用，形成脂性自由基和脂质过氧化物（LPO），LPO的含量可反映组织中自由基的含量和脂质过氧化的程度，MDA是LPO的终产物，所以测定MDA含量可以间接反映皮瓣缺血再灌注后自由基对组织的损伤程度［21］。正常机体内有自由基不断产生，同时又有正常清除机制发挥作用，所以不会形成自由基的大量堆积而造成机体损害，但是在再灌注损伤时，机体消耗了大量的抗自由基的酶类及抗氧化剂，这样就使它们清除自由基的能力显得捉襟见肘，最终可导致自由基生成增多损伤组织细胞［22-23］。维生素E组MDA值为（15.6379±0.8037）nmol/g，明显低于生理盐水组，表明维生素E可以减轻缺血再灌注时氧自由基引发的脂质过氧化作用，降低皮瓣组织再灌注时MDA的活性，对皮瓣缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。这与维生素E可以减少氧自由基生成及清除氧自由基的抗氧化作用机制有关。李晖等［24］通过对家兔肢体缺血再灌注损伤的研究，证实维生素E可以显著减低再灌注后MDA的含量，对肢体缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，这与本实验中维生素E可以降低大鼠皮瓣组织中MDA的量研究结果一致。

生理盐水组大鼠皮瓣缺血再灌注后SOD值为（32.4182±0.8428）U/mgprot，明显低于假手术组，说明皮瓣缺血再灌注后SOD逐渐失活，丧失了其清除氧自由基的能力，失去其保护作用。SOD是体内一种最主要的氧自由基清除剂，是天然抗氧化酶。SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基（O2-·），保护细胞免受损伤。SOD活性的高低可间接反映出机体清除自由基的能力，抗氧化剂的缺乏可使氧自由基的水平升高，故测量SOD的活性可反映组织内自由基水平和脂质过氧化作用的程度［25-29］。维生素E组SOD值为（57.9427±1.1803）U/mgprot，明显高于生理盐水组，表明维生素E可明显提高SOD活性，对氧自由基的产生起了明显的抑制作用，对皮瓣缺血再灌注损伤起到保护作用，这与SOD能特异性地清除超氧阴离子自由基的抗氧化作用机制有关。蔡虹静等［9］利用大鼠肾脏缺血再灌注模型研究证实，维生素E能减轻肾脏的缺血再灌注损伤，并通过增强SOD活性，清除氧自由基，减轻脂质过氧化作用，对肾脏缺血再灌注损伤具有保护作用，这与本实验中维生素E可以提高大鼠皮瓣组织中SOD活性水平研究结果一致。

综上所述，笔者认为维生素E可降低MDA含量，提高SOD活性，有效抑制氧自由基的产生，减轻脂质过氧化反应和自由基对生物膜的损伤，对皮瓣缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。在皮瓣移植术前，预先给予腹腔注射维生素E可以明显减轻术后皮瓣的坏死程度。

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Protective Effect of Vitamin E on Rat Flaps with Ischemia-reperfusion Injury/

TONG Rui-bing，XU Yong，DONG Le-le.//Medical Innovation of China，2016，13（26）：020-023

Objective：To investigate the protective effect of vitamin E on rat flaps with ischemiareperfusion injury.Method：A total of 30 healthy female Wistar rats were used to establish ischemia-reperfusion injured skin flap along superficial epigastricartery，all rats were randomly divided into the sham-surgery group，vitamin E group and the saline group，each group had 10 rats.The ischemia-reperfusion injury was not induced in the sham-surgery group，an intraperitioneal injection of vitamin E（100 mg/kg） was given in the vitamin E group one hour before operation，saline（the same volume） was given in the saline group one hour before operation. Distal tissue was selected from skin flap（middle edge flap full-thickness flap tissue 1 cm×1 cm） in both vitamin E group and saline group 2 hour after ischemia 1 hour after reperfusion，as well as in the sham-surgery group 3 hours after operation to measure superoxide dismutase（SOD） and malonaldehyde（MDA） contents，pathological tissue changes were observed under light microscope.Result：The MDA content in the saline group were significantly higher than those of the sham-surgery group and vitamin E group，the differences were statistically significant （P＜0.05）.The SOD activity in the saline group were significantly lower than those of the sham-surgery group and vitamin E group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.The sham-surgery group had no obvious change of tissue trauma，the saline group flap tissue had more obvious damage，the vitamin E group was significantly better than that of the saline group.Conclusion：Vitamin E can resist lipid peroxidation of free radicals，and play an important protective role in alleviating skin flap ischemia-reperfusion injury.

Vitamin E； Flap； Ischemia-reperfusion injury

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.26.006

2016-05-12） （本文编辑：李颖）

①内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院 内蒙古 包头014010

仝瑞兵