香加皮有效成分提取工艺和检测方法的研究进展

李瑞雪　张继全，2　吴　飞，2　冯　怡，2.上海中医药大学中药现代制剂技术教育部工程研究中心，上海20203；2.上海张江中药现代制剂技术工程研究中心，上海20203

香加皮有效成分提取工艺和检测方法的研究进展

李瑞雪1张继全1，2吴飞1，2冯怡1，2
1.上海中医药大学中药现代制剂技术教育部工程研究中心，上海201203；2.上海张江中药现代制剂技术工程研究中心，上海201203

香加皮是用于治疗类风湿性关节炎的传统中药材。随着现代研究的不断深入，其相关药理作用的起效成分逐步明确，相应的制备工艺和检测手段也逐渐完善。本文简述了香加皮中五大类有效成分的提取工艺和检测方法：C21甾体苷类一般采取乙醇溶液提取，使用大孔树脂柱纯化或者制备液相进行分离制备，多以HPLC-UV法（高效液相色谱法）进行分离检测；强心苷类用甲醇或乙醇超声提取，采用紫外分光光度法和HPLC法检测；醛类采用硅胶、十八烷基硫酸钠键合相（ODS）柱色谱等方法处理，HPLC法和气相色谱-质谱联用法（GC-MS法）分析；脂肪酸类和其他类的提取和检测方法也有涉及，为香加皮中相关成分的新药研发提供参考。

香加皮；有效成分；提取工艺；检测方法；C21甾体苷；强心苷

香加皮Cortex Periplocae为萝摩科植物杠柳Periploca sepium Bunge的根皮，又被称为北五加皮、杠柳皮或者香五加皮。最早记载在古籍《神农本草经》［1］，《中国药典》自1977年也均有收载，功能主治为祛风湿、强筋骨，用于心悸气短、下肢浮肿、风寒湿痹、腰膝酸软。

香加皮中药效活性成分主要分为C21甾体苷、强心苷、醛类化合物和有机酸类、三萜类、寡糖等化合物［2-5］，其中C21甾体苷和强心苷的药理活性被作为主要研究对象［6］，在2015年版《中国药典》中醛类化合物4-甲氧基水杨醛为中药材的含量控制指标［7］。由于不同类型化合物的极性相差较大，根据目标成分不同选择的提取工艺差异也较大，检测方法也有所不同。本文对近年来香加皮的提取工艺和检测方法研究进展进行综述。

1　提取工艺

1.1C21甾体苷

迄今为止，在香加皮中33种C21甾类成分被发现，且均为孕甾烯醇类化合物［8］，具有一系列药理活性，中国科学院药物研究所左建平和赵维民课题组对C21甾体苷的药理活性进行了深入研究［9-14］。在2008年发现了具有阻止风湿性关节炎病变进展的代表性化合物杠柳苷C（periploside C，PSC）［15］。

目前对C21甾体苷的提取、纯化工艺研究不多，药理活性研究的成分主要来自于实验室规模的提取和实验室级别的分离制备［9-16］。由于C21甾体苷极性较小，一般采取高浓度的乙醇溶液提取，然后使用大孔树脂柱纯化或者制备液相分离制备［17］。

将香加皮用95%乙醇提取，提取液浓缩至干，水溶解后氯仿萃取，氯仿层经硅胶柱，以石油醚-丙酮梯度洗脱，得到的PSC纯度达98%以上［18-19］。

将香加皮以70%乙醇加热回流提取，浓缩至无醇，经AB-8型大孔树脂梯度洗脱后，将95%乙醇洗脱液按制备HPLC条件进行分离，发现一新的C21甾体化合物杠柳苷P［20］。

1.2强心苷

目前已发现2个强心苷元、2个强心苷，共计4个强心苷类化合物，均为甲型强心苷，其中杠柳毒苷的药效活性被广泛研究。杠柳毒苷又名杠柳苷G（periploside G），主要临床药效为质量慢性充血性心力衰竭和心脏性浮肿［21］。

以杠柳毒苷作为指标成分，用不同浓度的乙醇进行提取时，杨虹［22］认为酒剂提取率最高，刘虹［23］认为60%乙醇提取率最高，徐广忠［24］则采用90%乙醇进行提取，李丹毅［25］在考察提取溶剂时，确定以70%乙醇作为最优提取溶剂。刘虹等［23］采用L9（34）正交实验甄选香加皮最优提取工艺，得到最佳工艺为：原料药投放6倍量的60%乙醇，提取2 h，提取3次。李丹毅等［25］考察最优提取溶剂和提取方法时，最终确定最佳提取条件为：原料中加入20倍体积的70%甲醇，超声提取2次，每次30min。

徐广忠等［24］取香加皮药材粗粉，90%乙醇超声3次，提取液浓缩成浸膏，石油醚萃取3次后继续浓缩。将浓缩液稀释至一定程度后过大孔树脂柱，依次用纯水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇冲洗，洗脱液浓缩后检测，其中70%乙醇部位中杠柳毒苷含量达到97%以上。

刘虹等［26］分别取杠柳的根皮、茎皮、叶子、果实、根木质部等部位，用以考察杠柳植株不同部位的杠柳毒苷含量的差异性。经60℃干燥4 h，60目过筛，加50%乙醇超声40 min后定容，结果显示，杠柳根皮中的杠柳毒苷含量远远高于其他部分。

1.3醛类和有机酸类

4-甲氧基水杨醛，为香加皮中主要的醛类成分，亦是产生香气的主要成分。但受产地和采收时期不同的影响，其含量亦有所不同［27］。2015年版《中国药典》［7］中，采用4-甲氧基水杨醛含量作为控制香加皮药材的质量标准。

采用试管预试和圆形滤纸色谱预试法，初步得出香加皮根皮中含脂肪酸类化学成分的结论［28］。

鲍志烨等［26］考察香加皮用蒸馏水、水、60%乙醇3种不同提取溶剂对香加皮“质量-毒性”的影响实验中，以4-甲氧基水杨醛为指标成分，香加皮药材用蒸馏水配制得全方水提取组分，加水或60%乙醇采用加热回流提取方法分别制得水提组分和醇提组分。经HPLC法测定3种提取方式中4-甲氧基水杨醛的含量由高到低分别为香加皮全方水提取组分、醇提组分、水提组分。

许俊洁等［27］优化顶空固相微萃取法用于香加皮等药材中挥发性成分的测定。通过考察萃取头、取样量、平衡时间、萃取温度、萃取时间和解吸附时间等一系列因素，获得顶空固相微萃取的最佳条件，后续结合GC-MS法分析香加皮中挥发性成分，结果表明，香加皮中挥发性成分为醛类、烃类和酯类，醛类中多为4-甲氧基水杨醛。

李金楠等［29］对香加皮中醛类和有机酸进行分离纯化。实验中，95%乙醇提取香加皮药材，浓缩后依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取部位经硅胶柱分别进行梯度洗脱，所得化合物结构鉴定显示其主要成分包括异香草醛、4-甲氧基水杨酸、4-甲氧基水杨醛等。

1.4其他成分

段漓童等［30］对香加皮中多糖进行了分离纯化，其分别依次使用石油醚、乙醚、80%乙醇回流提取去除杂质，然后以水提醇沉法制备得到多糖。测定结果显示香加皮中多糖含量约为5%，其中D-甘露糖、乳糖和葡萄糖是多糖的重要组成单元。

2　检测方法

2.1C21甾体化合物

目前对于C21甾体化合物的制备纯化和结构鉴定研究虽然较活跃，但是检测方法的报道较少。赵祎武等［33］就香加皮中7种孕甾烷糖苷类成分含量的HPLC检测方法进行研究，采用菲罗门C18色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱，在264 nm检测波长下，测定7种成分的含量。结果显示，进样量与峰面积有着良好的线性关系，精密度、重复性和加样回收率良好，12 h内具有稳定性，结果表明，该方法可作为香加皮药材质量控制的方法，且可为香加皮制剂的相关质量控制提供方法学参考。

刘颖等［20］将香加皮提取的化合物通过正离子高分辨质谱、香草醛-浓硫酸反应，采用NMR及TOFMS技术鉴定为C21甾体化合物，并命名为杠柳苷P。

2.2强心苷类

贾素云等［34］采用香加皮的70%乙醇提取液，在278 nm波长处紫外检测提取液中杠柳毒苷的含量，提取液质量浓度在0.5×10-2～4.0×10-2mg/mL具有良好的线性关系。

刘虹等［35］以抗心衰为应用目的，以杠柳毒苷和杠柳苷元为指标成分，在实验中采用高效液相色谱法，乙腈-0.5%磷酸（26∶74）为流动相，检测波长为220 nm，定量测定香加皮提取物中两种物质的含量。

任晓亮等［36］同时测定杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛，并对流动相配比进行了改进。之前文献报道［37］的流动相为乙腈∶水（27∶73），流速1.0mL/min，检测波长220 nm，在此基础上，加入了一定量的甲醇，使得分析周期缩短并改善了色谱法的拖尾现象。

2.3醛类和有机酸类

李天祥等［38］以不同收采期、不同产地的香加皮中4-甲氧基水杨醛的含量为研究对象，将提取液经HPLC法测定，结果表明，不同收采期不同产地香加皮中4-甲氧基水杨醛的含量存在较大差异。

黄荣华等［39］改进了用HPLC测定4-甲氧基水杨醛的含量时，加入内标物质对羟基甲酸丁酯的方法，采用C18柱，高效液相色谱法，流动相为甲醇-水-醋酸（70∶30∶2），检测波长为278 nm。该方法具有简便、准确、重复性好等优点。

许俊洁等［30］用GC-MS法分析香加皮中的挥发性成分时，共计分离出了19个化合物，经鉴定占挥发性成分总量的93%，其中4-甲氧基水杨醛占88.7%。

佟玲等［40］测定香加皮甲醇提取液中异香草醛的含量，用反相高效液相色谱法结果显示，提取液浓度在1.65～13.7μg/mL范围内，具良好线性关系。

李莉［41］采用GC-MS法分析香加皮中的脂肪酸成分，共鉴定出包括棕榈酸、亚油酸、油酸、亚麻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、花生酸等在内的21种脂肪酸，其中，不饱和脂肪酸占总量的51.87%，并且多不饱和脂肪酸占总量的36.91%。

2.4其他成分

段漓童等［32］对香加皮中多糖成分的测定使用了硫酸苯酚比色法：精密称取干燥香加皮粉末，用80%乙醇和去离子水分别索氏提取，吸取提取液加苯酚和浓硫酸，测定吸光度，测得香加皮中多糖成分的含量为5.38%。

3　小结

中医临床上，香加皮和五加皮由于外形相似容易混淆、混用。但香加皮和五加皮无论在主要成分、药理作用还是在临床应用方面都有所不同。因为二者价格偏差，长期以来，多数的掺伪发生在以香加皮冒充五加皮，但如果过度使用香加皮，可由于香加皮中的强心苷类毒性成分造成患者中毒［42-43］，为保证临床用药的安全以及合理使用，老年患者及有高血压的患者应慎用香加皮［43-46］，并且在使用含有五加皮的处方或者保健品时注意香加皮掺伪。

随着对香加皮有效部位和有效成分研究的不断深入，其所具有的强心［47-48］、抗癌［49-50］、抗炎、免疫调节［51］以及细胞分化诱导、杀虫、镇痛等生理作用相继被发现，并有待继续深入探究。目前，药效成分主要来自于香加皮的中药新药有已经上市的有芪苈强心胶囊（石家庄以岭药业股份有限公司，国药准字Z20040141），中科院药物研究所正在开发的用于抑制类风湿性关节炎病变恶化的杠柳苷类中药五类新药，同时中科院药物研究所和上海有机所合作打通了PSC的实验室全合成路径［52］，香加皮的临床价值和新药开发前景光明，将掀起一轮研究和开发的热点［53-55］。

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Advances in research on extraction process and analytical method of effective ingredients in Cortex Perip locae

LIRuixue1ZHANG Jiquan1，2WU Fei1，2FENG Yi1，2
1.Ministry of Education，Engineering Research Center of Modern Preparation Technology of Traditional Chinese Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China；2.Engineering Research Center，Modern Preparation Technology of Traditional Chinese Medicine of Zhangjiang Shanghai，Shanghai 201203，China

Cortex Periplocae is one kind of traditional Chinese medicines for the treatment of rheumatoid arthritis. With the continuous research，the related pharmacological ingredients have been discovered gradually while the corresponding extraction process and analytical method have been widely studied.The extraction process and analytical method of 5 kinds of ingredients in cortex periplocae were summrized in this paper.C21steroidal glycosideswere generally extracted by ethanol，purified bymacroporous resin or separated by preparative HPLCmethod，detected by ultraviolet-visible detect.Cardiac glycosides were ultrasonic extracted with methanol or ethanol.Cardiac glycosides were quantitatively analyzed by ultraviolet-visible spectrometry or HPLCmethod.Aldehydes were purified by silica gel and ODS column chromatography，and analyzed by HPLC or GC-MS.This paper also summrized fatty acids and other ingredients.The advances in research on the extraction process and analyticalmethod have been reviewed in this paper，in order to provide references for development of the related new drugs.

Cortex Periplocae；Effeective ingredients；Extration process；Analytical method；C21steroidal glycosides；Cardiac glycosides

R927.11

A

1673-7210（2016）06（c）-0037-05

上海市卫计委项目资助项目（ZY3-CCCX-3-5001）；上海市科委平台资助项目（15DZ2292000）。

李瑞雪（1991.8-），女，上海中医药大学2014级中药学专业在读硕士研究生；研究方向：中药新药研究。

张继全（1977.6-），男，硕士，高级工程师；研究方向：中药新产品开发、中药工程化研究。吴飞（1983.8-），男，上海中医药大学2015级中药学专业在读博士研究生；研究方向：中药制剂分析和药物分析。

（2016-02-27本文编辑：赵鲁枫）