第二代高通量测序技术的原理及其在医学中的应用进展

杜兵兵



第二代高通量测序技术的原理及其在医学中的应用进展

杜兵兵

【摘要】第二代高通量测序技术近年来取得了较快发展，与第一代测序技术相比具有速度快、准确率高、成本低等优点，主要包括454测序技术、Solexa测序技术以及SOLID测序技术。高通量测序技术在医学领域的研究越来越广泛，本文介绍了几种高通量测序技术的作用原理以及它们在临床方面的应用情况。

【关键词】高通量测序技术；454测序技术；Solexa测序技术；SOLID测序技术；临床应用

2005年Nature首次报道了454公司最新的基于微乳液PCR技术的高通量测序技术[1]，之后全球各个科研机构和生物公司相继开展高通量测序技术的研究工作。在这些竞争中脱颖而出的有罗氏公司的454测序、Illumina公司的Solexa测序以及ABI公司的SOLID测序[2]，它们逐渐成为新一代高通量测序技术的代表者。这些测序技术已经越来越广泛地应用于医学领域，主要运用于肿瘤、病原生物学等的预防、检测及治疗，成为临床研究领域的重要技术手段。

1　第二代高通量测序的原理

1.1454高通量测序

454高通量测序是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术。根据样品种类和实验目的，将DNA文库固定在相应的捕获磁珠上，形成油包水混合物，接着经过乳液PCR扩增形成单分子多拷贝的分子簇．随后将乳液体系里释放出来的磁珠放入VFP板的小孔进行后续的测序，对每个小孔中的DNA片段分子进行准确快速的碱基序列分析[3]。454测序成本较高，限制了该平台的市场化普及。

1.2Solexa高通量测序

Solexa高通量测序采用的是边合成边测序，先根据实验需要将目标DNA处理成小片段，接着将片段DNA回收并通过两个接头链接，这两个接头是通用的，之后将其处理成为单链状态，这时就会与芯片表面的碱基进行互补杂交固定在芯片上，另一端随机与相邻的另一个引物结合形成“桥”，反复上述过程30次左右则每个分子被放大1 000倍以上，成为单克隆的DNA簇，然后通过带荧光标记的 dNTP“可逆终止子”（3’端被一个叠氮基堵住）进行边合成边测序。用不同荧光标记不同碱基则可以激发产生不同颜色的荧光，统计每一轮反应结束后采集到的荧光信号，通过处理就可以知道原来模板DNA片段的序列[4]。该平台成本低、性价比高，是主要的测序平台。

1.3SOLID高通量测序

SOLID高通量测序技术以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接合成为基础，采用DNA连接酶实现边合成边测序。该技术可以很大程度上降低错误率。因为测序过程中应用双碱基编码，即每个碱基被重复阅读2次，这样就使得SOLID系统原始碱基数据的准确度大于99.94%。该方法测序时仪器会自动加入带有荧光标记的四种核苷酸探针，加入的探针与引物发生相应的连接反应，之后通过激发末端的荧光标记，识别碱基类型完成测序。SOLID测序的特点是是高通量、高准确度[5]。

2　第二代高通量测序在临床上的应用

2.1肿瘤研究方面

肿瘤是生物有机体受到致癌因素作用后，局部组织的某些细胞失去对其生长的正常调控，导致异常增生而形成的病变。有机构预测至2020年将有2 000万新发癌症病例，其中绝大部分将发生在发展中国家。高通量测序技术在肿瘤学的前期研究、临床诊断和治疗恢复方面都具有重要作用，它为肿瘤研究提供了一种与基因芯片技术互补的新工具，可以进行肿瘤基因组序列的再测序，从而达到对肿瘤基因组拷贝数、不同类别突破、基因相关性以及多态性的分析[6]。

2.2病原生物学检测

病原微生物可以侵犯人体，引起感染甚至传染病。高通量测序技术的出现使得病原体在检测前不再需要进行培养分群即可直接测序鉴别。2011年5月德国由于大肠杆菌感染引起3 000多人感染。当地医疗机构采用Illumina HiSeq平台测序系统对病原体进行了紧急基因组测序分析，在不到10天时间内即完成了测序工作，对病原体进行了详细的毒力、耐药和遗传进化分析，最后发现该病原体是Shiga毒素E.coliO104:H4株[7]。

参考文献

[1] Margulies M，Egholm M，Altman WE，et a1． Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors[J]． Nature，2005，437（7057）：376-380．

[2]Shendure J，Ji H． Next-generation DNA sequencing[J]． Nat Biotechnol，2008，26（10）：1135-1145．

[3]Rothberg JM，Leamon JH． The development and impact of 454 sequencing [J]． Nat Biotechnol，2008，26（10）：1117-1124．

[4]许波，张伟强，冯晓曦，等． 转录组测序技术在玉米中的应用研究进展[J]． 玉米科学，2014，22（1）：67-72．

[5]杨烨，刘娟． 第二代测序序列比对方法综述[J]． 武汉大学学报，2012，58（5）：463-470．

[6]Piffer GP． Besraatinia A Mutational spectra of human cancer[J]． Hum Genet J，2009，125（5）：493-506．

[7]Rohde H，Qin J，Cui，et a1． Open-source genomic analysis of Shiga-toxin-producing E．coli O104：H4 [J]． N Engl J Med，2011，365（8）：718-724．

·论著·

The Working Principle of Second-generation High-throughput Sequencing Technology and its Application in Clinical Medicine

DU Bingbing, Luohe Medical College, Luohe 462002, China

[Abstract]The second-generation high-throughput sequencing technology has achieved rapid development in recent years. Compared with the first generation, the second-generation sequencing technology is with the advantages of faster, higher precision, and lower cost. The main technologies include 454 sequencing technology, Solexa sequencing technology and SOLID sequencing technology. High-throughput sequencing technology is more widely used in medical areas. This is a brief overview for the working principle of the second-generation highthroughput sequencing and its application in clinical medicine

[Key words]High-throughput sequencing, 454 sequencing technology, Solexa sequencing technology, SOLID sequencing technology, Clinical application

doi：10．3969/j．issn．1674-9308．2016．03．153

【文章编号】1674-9308（2016）03-0215-02

【中图分类号】G642

【文献标识码】A

作者单位：462002 漯河医学高等专科学校