盐霉素对人鼻咽癌CNE2/DDP细胞顺铂耐药的影响及其机制

陈冬杰，廖雪阳，陈可绪，李毅斌，汪森明

(南方医科大学珠江医院，广州510282)

盐霉素对人鼻咽癌CNE2/DDP细胞顺铂耐药的影响及其机制

陈冬杰，廖雪阳，陈可绪，李毅斌，汪森明

(南方医科大学珠江医院，广州510282)

目的 探讨盐霉素对人鼻咽癌CNE2/DDP细胞顺铂耐药的影响及其可能的作用机制。方法将人鼻咽癌CNE2/DDP细胞随机分为四组，分别加入2 μg/mL顺铂(顺铂组)、8 μmol/L盐霉素(盐霉素组)、2 μg/mL顺铂和8 μmol/L盐霉素(联合组)、0.1%二甲基亚砜(对照组)进行处理。采用CCK-8法检测各组细胞增殖抑制率，流式细胞术检测细胞凋亡率，Western blotting法检测Wnt/β-catenin信号通路(β-catenin、p-LRP6)、mTORc1信号通路(P70S6K、p-P70S6K、S6、p-S6)相关蛋白相对表达量，荧光分光光度法检测caspase3、caspase9活性。结果与对照组比较，顺铂组、盐霉素组、联合组细胞增殖抑制率、凋亡率和caspase3、caspase9活性均升高(P均<0.05)；顺铂组、盐霉素组和联合组上述指标均逐渐升高，两两比较P均<0.05。β-catenin、p-LRP6、p-P70S6K、p-S6蛋白相对表达量：顺铂组和对照组均高于盐霉素组和联合组(P均<0.05)，顺铂组与对照组、盐霉素组与联合组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。P70S6K、S6蛋白相对表达量：各组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论盐霉素可以逆转人鼻咽癌CNE2/DDP细胞的顺铂耐药；激活caspase活性、抑制Wnt/β-catenin和mTORc1信号通路可能是其作用机制。

鼻咽癌；盐霉素；顺铂；耐药；细胞凋亡

鼻咽癌是致死率最高的头颈部肿瘤[1,2]，放疗是惟一可能治愈早期鼻咽癌的方法[3]，联合放化疗是局部晚期鼻咽癌的标准治疗方法[4]。顺铂是中晚期鼻咽癌常用的化疗药物之一，但部分患者治疗过程中会对顺铂产生耐药性，大大降低了疗效[5,6]。盐霉素是一种选择性乳腺癌干细胞抑制物，可抑制多种肿瘤细胞的增殖和分化[7]。2015年4月～2016年1月，我们观察了盐霉素对人鼻咽癌CNE2/DDP细胞顺铂耐药的影响，现分析结果并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人鼻咽癌CNE2/DDP细胞由南方医科大学肿瘤研究所馈赠，采用含10%胎牛血清的RMPI 1640培养基于37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。药物及试剂：顺铂由珠江医院肿瘤中心提供，盐霉素购于美国Sigma公司，均溶于二甲基亚砜(DMSO)中，于-20 ℃冰箱中避光保存。抗p-LRP6(Ser1490) 抗体购于英国Abcam公司，抗S6抗体、抗p-S6(Ser235/236)、抗P70S6K抗体、抗p-P70S6K(Thr389)抗体、抗β-catenin抗体、抗GADPH抗体均购于美国Affinity公司。

1.2 细胞增殖抑制率检测 采用CCK-8法。取对数生长期的CNE2/DDP细胞，调整细胞密度为5×104个/mL，接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液100 μL，培养24 h，随机分为顺铂组、盐霉素组、联合组和对照组。取出溶于DMSO的顺铂和盐霉素，采用RMPI 1640培养基将其浓度调整为2 μg/mL和8 μmol/L。顺铂组加入含2 μg/mL顺铂的培养基100 μL，盐霉素组加入含8 μmol/L盐霉素的培养基100 μL，联合组加入含2 μg/mL顺铂及8 μmol/L盐霉素的培养基100 μL，对照组加入含0.1% DMSO的培养基100 μL，每组设置5个复孔。作用48 h后终止培养，每孔中加入预先配好的CCK-8试剂，继续放入孵育箱中培养2 h。取出培养板，酶标仪450 nm波长下测定各孔光密度值(OD值)，实验重复3次。细胞增殖抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.3 细胞凋亡率检测 采用流式细胞术。取对数生长期CNE2/DDP细胞，调整细胞密度为1.5×105个/mL，接种于6孔板中，每孔1 mL，培养24 h。顺铂组加入含2 μg/mL顺铂的培养基2 mL，盐霉素组加入含8 μmol/L盐霉素的培养基2 mL，联合组加入含2 μg/mL顺铂及8 μmol/L盐霉素的培养基2 mL，对照组加入含0.1% DMSO的培养基2 mL。作用48 h后终止培养，将旧培养液转移至10 mL离心管内。收集各孔细胞并转移至旧培养液所在离心管中，采用胰酶进行消化(已去除EDTA)，1 000 r/min离心5 min，去上清。收集细胞，采用4 ℃预冷的PBS洗涤3次，1 000 r/min离心5 min，弃上清。400 μL Binding Buffer悬浮细胞，加入5 μL Annexin V-FITC混匀，加入5 μL Propidium Iodide混匀。在室温、避光条件下反应10 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率，实验重复3次。

1.4 Wnt/β-catenin、mTORc1信号通路相关蛋白表达检测 参照1.3的方法进行接种及分组处理，作用48 h后采用4 ℃预冷的PBS进行洗涤，弃上清。每孔加入200 μL RIPA裂解液，冰上裂解20～30 min。将裂解的细胞收集至EP管中，于4 ℃条件下1 200 r/min离心20 min，将含蛋白的上清转移到新的EP管中。采用SDS-PAGE凝胶电泳分离，电泳湿转至PVDF膜，转移至4 ℃冰箱中，5% BSA封闭2 h，加入一抗孵育过夜。PBS洗涤PVDF膜3次，每次15 min；加入HRP标记的二抗，室温下孵育1 h；PBS洗涤3次，每次15 min。进行ECL化学发光反应及曝光，以GADPH作为对照，实验重复3次。Wnt/β-catenin信号通路(β-catenin、p-LRP6)、mTORc1信号通路(P70S6K、p-P70S6K、S6、p-S6)蛋白相对表达量以目的蛋白灰度值与GADPH灰度值的比值表示。

1.5 caspase3、caspase9活性检测 采用荧光分光光度法。参照1.3的方法进行接种及分组处理，作用48 h后，收集细胞。冰上裂解30 min，4 ℃条件下1 200 r/min离心1 min，取上清置于EP管。加入相应的caspase底物，充分混匀后，加入96孔板中，避光孵育4 h。每组设置3个复孔，以酶标仪405 nm波长下各孔OD值表示caspase3、caspase9活性。实验重复3次。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率和凋亡率比较 与对照组比较，顺铂组、盐霉素组、联合组细胞增殖抑制率和凋亡率均升高(P均<0.05)。顺铂组、盐霉素组和联合组细胞增殖抑制率和凋亡率均逐渐升高，两两比较P均<0.05。见表1。

表1 各组细胞增殖抑制率和凋亡率比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与顺铂组比较，#P<0.05；与盐霉素组比较，△P<0.05。

2.2 各组Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达比较 顺铂组和对照组 β-catenin、p-LRP6蛋白相对表达量均高于盐霉素组和联合组(P均<0.05)；顺铂组和对照组比较、盐霉素组和联合组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与顺铂组比较，#P<0.05。

2.3 各组mTORc1信号通路相关蛋白表达比较 各组P70S6K、S6蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。顺铂组和对照组p-P70S6K、p-S6蛋白相对表达量均高于盐霉素组和联合组(P均<0.05)；顺铂组和对照组比较、盐霉素组和联合组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 各组mTORc1信号通路相关蛋白相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与顺铂组比较，#P<0.05。

2.4 各组caspase3、caspase9活性比较 与对照组比较，顺铂组、盐霉素组和联合组caspase3、caspase9活性均升高(P均<0.05)。盐霉素组、顺铂组和联合组caspase3、caspase9活性均逐渐升高，两两比较P均<0.05。见表4。

3 讨论

在鼻咽癌的治疗中，逆转顺铂耐药性药物的研究为当前热点。盐霉素可抑制多种肿瘤细胞，包括肝癌[8]、乳腺癌[9]、胰腺癌[10]、前列腺癌[11]、肠癌[12]、鼻咽癌[13]等，但其对鼻咽癌细胞的作用及其对顺铂耐药性影响的报道较少。前期研究显示，顺铂作用于CNE2/DDP细胞的IC50为5.93 μg/mL，盐霉素为10 μmol/L，结合相关参考文献，本研究分别选取低于两种药物IC50的浓度为工作浓度，分别为2 μg/mL、8 μmol/L[13,14]。本研究结果显示，联合组细胞增殖抑制率和凋亡率均明显高于顺铂组、盐霉素组。提示盐霉素能提高CNE2/DDP细胞对顺铂的敏感性，并逆转其对顺铂的耐药性；盐霉素联合顺铂可能成为鼻咽癌顺铂耐药患者的一种新的治疗方案。

表4 各组caspase3、caspase9活性比较(OD值

注：与对照组比较，*P<0.05；与顺铂组比较，#P<0.05；与盐霉素组比较，△P<0.05。

研究表明，盐霉素对鼻咽癌细胞的抑制作用可能与其抑制Wnt/β-catenin信号通路有关，但具体的机制并未完全清楚[14]。Wnt/β-catenin、mTORc1信号通路均与肿瘤的增殖和侵袭密切相关，且两条通路之间可能存在交叉[15～19]。因此能够同时抑制Wnt/β-catenin信号通路及mTORc1信号通路的物质有可能成为新型的抗肿瘤药物。LRP6是Wnt/β-catenin信号通路中的关键Wnt协同受体，LRP6的磷酸化在Wnt/β-catenin信号通路的激活过程中起关键作用[20,21]。本研究发现，顺铂组和对照组 β-catenin、p-LRP6、p-P70S6K、p-S6蛋白相对表达量均高于盐霉素组和联合组，而顺铂组和对照组比较、盐霉素组和联合组比较差异均无统计学意义。提示盐霉素可同时抑制Wnt/β-catenin与mTORc1信号通路，而顺铂无此作用；盐霉素提高CNE2/DDP细胞的顺铂敏感性、逆转其耐药性的作用机制可能与其抑制Wnt/β-catenin与mTORc1信号通路有关。本研究盐霉素组、顺铂组和联合组caspase3、caspase9活性逐渐升高，说明caspase的激活可能是盐霉素作用的另一种相关机制。

综上所述，盐霉素可以逆转人鼻咽癌CNE2/DDP细胞的顺铂耐药性；激活caspase活性、抑制Wnt/β-catenin和mTORc1信号通路可能是其作用机制。

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一些常用词汇可直接用缩写

胎牛血清(FBS) 体质量指数(BMI) 天冬氨酸转氨酶(AST)

磷酸盐缓冲液(PBS) 总胆固醇(TC) 人类免疫缺陷病毒(HIV)

变异系数(CV) 甘油三酯(TG) 甲型肝炎病毒(HAV)

磁共振成像(MRI) 低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C) 乙型肝炎病毒(HBV)

血红蛋白(Hb) 高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C) 丙型肝炎病毒(HCV)

核因子-κB(NF-κB) 重症监护病房(ICU) 酶联免疫吸附测定(ELISA)

逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR) 严重急性呼吸综合征(SARS) 动脉血氧分压(PaO2)

肿瘤坏死因子(TNF) 动脉血二氧化碳分压(PaCO2) 干扰素(IFN)

凝血酶时间(TT) 一氧化氮(NO) 白细胞介素(IL)

Effect of salinomycin on cisplatin resistance of human nasopharyngeal carcinoma cells CNE2/DDP and its mechanisms

CHENDongjie,LIAOXueyang,CHENKexu,LIYibin,WANGSenming

(ZhujiangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510282,China)

Objective To investigate the effect of salinomycin on the cisplatin resistance of human nasopharyngeal carcinoma CNE2/DDP cells and its possible mechanisms. Methods CNE2/DDP cells were randomly divided into four groups, which were separately treated with 2 μg/mL cisplatin (cisplatin group), 8 μmmol/L salinomycin (salinomycin group), 8 μmmol/L salinomycin + 2 μg/mL cisplatin (combination group) and 0.1%DMSO (control group). Inhibitory rate of proliferation was assessed by the Cell Counting Kit 8. Apoptosis rate was measured by flow cytometry. Caspases3 and caspase9 activity was assessed by a colorimetric assay utilizing specific substrates. The protein expression of Wnt/β-catenin signaling pathway (β-catenin and p-LRP6) as well as mTORc1 signaling pathway (P70S6K, p-P70S6K, S6, and p-S6) was evaluated by Western blotting. Results Compared with the control group, the inhibitory rate, apoptosis rate, Caspase-3/9 activity were increased in the cisplatin group, salinomycin group, and combination group (allP<0.05). Indexes mentioned above were increased the most in the combination group while salinomycin group ranked the second and cisplatin group ranked the third (allP<0.05). The expression of β-catenin, p-LRP6, p-P70S6K, and p-S6: the salinomycin group and combination group was decreased as compared with the cisplatin group and control group (allP<0.05). Meanwhile, no significant differences were found between salinomycin group and combination group as well as between the cisplatin group and control group (allP>0.05). No significant difference was found in the expression of P70S6K and S6 between these four groups (allP>0.05). Conclusion Salinomycin can reverse the cisplatin resistance of human nasopharyngeal carcinoma cells CNE2/DDP which is possibly mediated by improving caspases activity and inhibiting both Wnt/β-catenin signaling pathway and mTORC1 signaling pathway.

nasopharyngeal carcinoma; salinomycin; cisplatin; drug resistance; apoptosis

广州市科技计划项目(2011Y2-00019-3)。

陈冬杰(1988-)，男，硕士在读，研究方向为盐霉素的抗肿瘤作用。E-mail： 15913106573@163.com

汪森明(1955-)，男，主任医师，博士生导师，研究方向为肿瘤内科治疗、恶性肿瘤介入治疗、射频消融治疗。E-mail： wsenming@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.006

R739.6

A

1002-266X(2016)48-0020-04

2016-03-29)