一株转化反式茴香脑产茴香酸菌株的筛选鉴定

王辛艳，申佩弘，华燕飞，李俊芳，张 敏，武 波

(1. 广西大学生命科学与技术学院，广西南宁530004；2. 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁530004；3. 广西民族师范学院生物与食品工程学院，广西崇左532200)

一株转化反式茴香脑产茴香酸菌株的筛选鉴定

王辛艳1，2，申佩弘1，2，华燕飞1，2，李俊芳1，张 敏1，武 波2，3

(1. 广西大学生命科学与技术学院，广西南宁530004；2. 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁530004；3. 广西民族师范学院生物与食品工程学院，广西崇左532200)

经过梯度驯化及富集筛选，从环境样品中分离获得348株能以反式茴香脑为唯一碳源的菌株。通过薄层层析法和反相高效液相法对转化液中的残余反式茴香脑和茴香酸进行定量分析，最后得到一株对反式茴香脑耐受能力和茴香酸产量都较高菌株WGBF9。在含体积分数为10%的反式茴香脑的种子培养基中，菌体的生物量为空白对照的37.42%，在含体积分数为20%反式茴香脑时，生物量也能达到空白对照的26.57%，说明WGBF9对反式茴香脑具有很高的耐受能力。将该菌株接种到复筛培养基中，30 ℃、转速200 r/min的条件下发酵36 h，茴香酸的摩尔生成率为17.9%。经形态学观察、生理生化等实验分析，初步鉴定WGBF9为恶臭假单胞菌A类变种(PseudomonasputidabiotypeA)中的一个亚种。

恶臭假单胞菌；反式茴香脑；茴香酸

茴香酸(Anisic acid)又名对甲氧基苯甲酸或4-甲氧基苯甲酸，广泛用于食品、化妆品、制药等多个行业中[1-3]，是很好的保鲜剂、保香剂、驱虫剂和杀卵剂。在化妆品中茴香酸既可以作为抑菌剂[4]，也可以作为生物体中黑色素产生的关键酶酪氨酸酶的抑制剂[5]；它同时也是改善脑部功能和精神记忆疾病的茴拉西坦[6]、治疗心律失常等心血管疾病的乙胺碘呋酮[7]、针对痛风及并发症疾病的苯溴马隆[8]、预防早产的利托君[9]等药物的中间物质；有学者通过化学合成法将茴香酸和甲酸合成茴香酸甲酯，后者具有水果气味和茴香的甜味，多用于调配各类香精[10]。

八角果实或枝叶蒸馏得到八角茴香油中反式茴香脑的体积比例达80%～90%。八角在中国的广西、广东、云南等亚热带气候地区的种植量大，是重要出口产品，占全球市场85%的份额，对中国的林业发展具有重要意义[11]。但由于缺乏好的技术，八角的深加工研究和实际应用并不多，其潜在的价值没有得到充分发掘[11-12]。在茴香油中茴香酸的含量低，难以直接分离。早些年，茴香酸多数是通过化学工艺获得[13]，近年来，基于对经济效益的追求，很多化学转化和微生物转化工艺不断被探索和改进[2，14-18]。微生物转化一直被公认为是一种环保、高效、经济的生产方法，在反式茴香脑的深加工中有广阔的运用前景。但受限于微生物对反式茴香脑的低耐受性及低转化率，分离的菌株，无论是担子菌、节杆菌还是假单胞菌，均尚未应用于茴香脑转化成茴香酸的工业化生产[2， 19-20]。本研究拟利用来自广西八角产区的样品，筛选出能耐受较高浓度反式茴香脑同时高产茴香酸的菌株，为反式茴香脑的生物转化提供微生物菌种资源。

1 实验材料

1.1 主要试剂

反式茴香脑(体积分数为98%+，色谱纯)、茴香酸(体积分数为99%+，色谱纯)、茴香醛(体积分数为99%+，色谱纯)均购于东京化成工业株式会社(TCI)；反式茴香脑(体积分数为98%+，分析纯)购于Adamas；乙腈和甲醇(色谱纯)购于Thermo Fisher Scientific；乙酸乙酯(分析纯)购于天津市富宇精细化工有限公司；其他化学试剂都为分析纯或者化学纯的国产试剂。

1.2 主要设备材料

GF254硅胶板(青岛海洋化工分厂)、UV-100型手提紫外灯(北京爱着华美科技有限公司)、E2695型高效液相色谱仪(Waters公司)、SW-CJ-2F型超净工作台(苏净安泰公司)、HVA-110型全自动灭菌锅(株式会社平山制作所)、MF3全自动菌落分析仪(杭州迅数科技有限公司)等。

1.3 菌种和载体

1.3.1 样品来源

在广西高峰林场界牌分厂八角树树下，以及广西大学桂树、玉兰树、棕榈树等树下采集土样，并采集八角落果、鲜果、树皮、腐叶等，共47个样品。每份样品10～15 g，装入样品袋贴上标签并记录采样时间和地点，存于实验室4 ℃冰箱待用。

1.3.2 菌种载体

野生菌WGBP9(本实验)，E.coliDH5α(购于TransGen Biotech)，pMDTM18-T(Ampr，购于Takara Bio)。

1.4 培养基

实验中所用的培养基由蒸馏水配置，不含糖类的培养基采用121 ℃蒸汽灭菌20 min，含糖类的培养基采用115 ℃蒸汽灭菌15 min。固体培养基中添加1.2～1.3 g/L琼脂粉。

1.4.1 类M9培养基[21](下文简称为LM9)

Na2HPO4·12H2O 17.14 g/L、KH2PO43 g/L、NH4Cl 1 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L、FeSO4·7H2O 0.02 g/L、CaCl20.02 g/L。

1.4.2 梯度筛选培养基

一级：LM9培养基+体积分数为0.2%反式茴香脑+5 g/L葡萄糖；二级：LM9培养基+体积分数为0.5%反式茴香脑+2 g/L葡萄糖；三级：LM9培养基+体积分数为0.7%反式茴香脑；四级：LM9培养基+体积分数为1%反式茴香脑。

1.4.3 初筛和复筛培养基

LM9培养基+体积分数为0.5%反式茴香脑。

1.4.4 种子培养基

葡萄糖15 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物2.5 g/L、KH2PO41 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.02 g/L、CaCl20.02 g/L。

2 实验方法

2.1 富集和分离

每份样品称取5 g，分别加入已灭菌的LM9培养基中，放入30 ℃摇床200 r/min震荡培养0.5 h。将菌液稀释成10-4、10-5、10-6、10-7倍菌悬液，于一级梯度培养基平板涂布，以相同条件培养36～60 h。挑取形态不同的单菌落，经过二、三级梯度培养基平板中划线，利用三级梯度培养基进行反复划线分离，直到出现稳定单菌落。将菌株接种于四级梯度培养基中培养，用种子培养基平板保存长势较好的菌株于4 ℃备用。

2.2 薄层层析法初筛

用接种针挑取单菌落接种于初筛培养基中，放入30 ℃摇床，200 r/min培养36～48 h。充分震荡菌液取一定体积菌液加入等体积的乙酸乙酯，放于200 r/min摇床混合40 min，1 000 r/min离心10 min，取上层有机相备用(下文简称为萃取液)。展层[22]：将10 μL萃取液点样于活化后的GF254硅胶板上，展层液中展层20 min，利用手提紫外灯检测，纪录茴香酸斑点较大或反式茴香脑斑点较小的菌株，选出菌种保存于-80 ℃。

2.3 反相高效液相色谱法(RP-HPLC)复筛

2.3.1 确定测试条件

反式茴香脑、产物茴香酸和茴香醛都具有特征苯环结构，在紫外光波段有特定吸收峰，可选择有紫外波长范围的PDA检测器进行检测。以紫外分光光度仪在190～400 nm对3种物质进行扫描，确定3种物质及混合时的特征吸收波长。利用Grace Smart RPC18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)确定液相色谱的条件。制作标准曲线，并通过精确度检测和加标回收率试验来确定色谱条件的可行性。

2.3.2 转化效率的计算

茴香酸摩尔生成率(%)=转化液中生成的茴香酸的摩尔量/加入的反式茴香脑摩尔量×100%。

降解反式茴香脑产茴香酸效率(%)=生成的茴香酸摩尔量/(初始反式茴香脑摩尔量-残余反式茴香脑摩尔量)×100%。

2.4 菌株对反式茴香脑耐受性

将培养12～16 h的菌液按1%接种量接种于LM9和种子培养基中，再分别加入不同浓度的反式茴香脑，于30 ℃、200 r/min恒温摇床中培养24 h，每个浓度设置3个平行。将收集到的菌体真空干燥，分别测出相应的生物量，分析菌株对反式茴香脑的耐受情况。

2.5 菌株的鉴定

2.5.1 形态学特征观察及生理生化实验

通过扫描电子显微镜、平板菌落形态观察等方式进行形态学特征观察，参照常见细菌鉴定手册[23]和伯杰氏细菌鉴定手册[24]进行生理生化特性实验研究。

2.5.2 Biolog鉴定

挑取新鲜菌种在BUG琼脂糖培养基中划线培养2～3次后，取平板中菌落制备浊度为90%～98%的菌悬液，接种于GEN III微孔板中，于30 ℃培养箱中培养24 h，利用Biolog全自动微生物鉴定仪读取数据，根据菌株对95种碳源利用的情况与数据库中菌种比对得出菌株的ID。

2.5.3 16S rRNA基因序列分析

提取目的菌株基因组总DNA，利用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)对16S rRNA基因进行扩增，得到的PCR产物与pMDTM18-T连接，转化E.coliDH5α感受态细胞，将目的菌株送到华大基因和上海生工测序。利用Chromas、Vsector NTI、MAGE 5.0等软件对序列进行加工、序列比对和构建进化树。

3 结果和讨论

3.1 高效液相色谱条件确定

图1 部分产茴香酸菌株转化液薄层层析图谱Fig.1 TLC result of strains of someproducing anisic acid

优化后得到的色谱条件为：混合标准样的检测波长为259 nm，流动相乙腈∶水=70∶30，流速为0.8 mL/min，加样量5 μL，等度洗脱，6.5 min内可以将混合样品很好分离。进行精密度实验和加标回收率实验验证，检测到标准样品和菌株转化液中的反式茴香脑和茴香酸含量的相对标准偏差RSD均小于0.97%，符合检测要求。

3.2 菌株的筛选

3.2.1 富集、纯化和初筛

经过富集和分离纯化从样品中分离出348株以反式茴香脑为唯一碳源的菌株。其中在含有体积分数为1%反式茴香脑的培养基中长势较好菌株有94株。将纯化后的菌株进行初筛，通过样品斑点的大小和颜色深浅与标准样比对，获得21株降解反式茴香脑且积累茴香酸的菌株，部分菌株转化液薄层层析结果见图1。

3.2.2 复筛

利用高效液相色谱法对产物定量，从而将初筛得到的21株菌进行复筛，结果有6株的茴香酸摩尔生成率较高，分别为WGAT73、WGBT39、WGBP9、WGBL34、WGYT2和WGZG4。转化液经高效液相色谱法测定结果见表1，发现该条件下菌株WGBP9的茴香酸积累最多，为17.9%，降解的反式茴香脑生成茴香酸的效率为21.98%，对反式茴香脑的降解率达到84.6%，具有较大的转化潜力。

表1 高效液相色谱法筛选检测结果

3.3 菌株对反式茴香脑的耐受性(说明利用种子培养基做耐受性的原因)

由于在筛选过程中利用了单一碳源为茴香脑的培养基及含葡萄糖的培养基进行筛选，并且在后期发酵过程中多利用的是含葡萄糖的培养基，因此将菌株WGBP9分别接种于添加了不同浓度的反式茴香脑的LM9培养基(无碳源)和种子培养基(含15 g/L葡萄糖)中培养，以便了解菌株对茴香脑的耐受性，可以为后期发酵条件优化提供参考。培养24 h后，耐受情况分别如图2和图3所示。

图2 菌株WGBP9在LM9培养基中对反式茴香脑耐受情况Fig.2 trans-Anethole tolerance of strain WGBP9 in LM9 medium

结果显示，不论在LM9培养基还是种子培养基中，菌株WGBP9的生物量都随着反式茴香脑浓度的增加不断减少，说明反式茴香脑对WGBP9生长有一定抑制作用。LM9培养基中没有碳源，因此以体积分数为0.1%的反式茴香脑添加量作为对照，在含体积分数为2.2%反式茴香脑的LM9培养基中生物量为对照的28.8%。而在种子培养基中，以不添加反式茴香脑的培养基作对照，在含体积分数为10%反式茴香脑的种子培养基中生物量为对照的37.42%，试着利用含体积分数为20%反式茴香脑的种子培养基培养，发现生物量为对照的26.57%。这说明WGBP9对反式茴香脑的毒性具有很高的耐受能力。

图3 菌株WGBP9在种子培养基中对反式茴香脑耐受情况Fig.3 trans-Anethole tolerance of strain WGBP9 in seed medium

3.4 菌株的鉴定

3.4.1 形态观察

挑取菌落在种子培养基平板中划线培养，30 ℃培养24 h，菌落形态见图4。WGBP9菌落直径为1.8～2.6 mm，乳白色略显黄色，圆形半透明，透镜状凸起，表面光滑平整边缘整齐，湿润粘稠，质地均匀。菌株WGBP9的革兰氏染色为紫红色，为革兰氏阴性菌。经过电镜扫描仪观察，菌体长度为0.4～2 μm，长短不均匀，短杆状，未见芽孢、鞭毛和荚膜。

3.4.2 生理生化鉴定

参照临床实验室标准化委员会CCLS的药敏实验标准[25]，利用纸片法测定菌株的抗生素敏感试验，结果为菌株对氨苄青霉素、壮观霉素、利福平、羧苄青霉素、氯霉素、万古霉素、头孢噻吩具有耐药性，其中：对氨苄青霉素、羧苄青霉素、万古霉素、头孢噻吩为高耐药性，对萘啶酮酸、庆大霉素、卡那霉素敏感，对链霉素、四环素为中介状态。

菌株WGBP9的生理生化特征鉴定结果见表2。与常见细菌鉴定手册和伯杰细菌鉴定手册中的菌株进行比对检索，发现WGBP9与假单胞菌属细菌特性最接近。

3.4.3 16S rRNA基因鉴定

经过华大基因和上海生工对菌株WGBP9的16S rRNA基因测序，序列与GenBank(NCBI网站)中有一定关联性的菌株的16S rRNA基因序列构建进化树(MAGE5.0中的最大似然法(Maximum Likelihood))，结果见图5。

序列比对结果和进化树构建显示：菌株WGBP9与多个假单胞菌属Pseudomonassp.细菌一致性都达到99%，其中亲缘性非常接近的包括登录号为NR113651的恶臭假单胞菌Pseuomonasputida、登录号为NR024662的变性假单胞菌Pseudomonasplecoglossicida和登录号为NR114224的蒙氏假单胞菌Pseuomonasmonteilii等假单胞菌属的细菌，可以确定WGBP9为假单胞菌属细菌。

3.4.4 BIOLOG鉴定

根据BIOLOG微生物自动鉴定系统对鉴定结果的评估，培养4～6 h时，SIM≥0.75，DIS≤0.5；培养16～24 h时，SIM≥0.5，DIS≤0.5。鉴定系统所给出的菌株名称即为该菌的种名，否则鉴定结果只能判定为该细菌的属名，甚至鉴定系统不能给出匹配的菌种ID。菌株WGBP9培养16～24 h后，通过BIOLOG微生物自动鉴定系统检测WGBP9并比对数据库，显示WGBP9与恶臭假单胞菌A类变种PseudomonasputidabiotypeA一致性最高，PROB=0.909，SIM=0.631，DIS=0.382，因此可确定WGBP9为恶臭假单胞菌PseudomonasputidabiotypeA。

表2 菌株WGBP9生理生化实验结果

注：“-”表示实验结果呈阴性，“+”表示实验结果呈阳性。

括号内为对应菌株16S rRNA基因序列的登录号。图5 菌株WGBP9的16S rRNA基因序列系统进化树Fig.5 The phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequence of strains WGBP9

综合BIOLOG鉴定的结果和菌株的形态观察、生理生化鉴定及16S rRNA基因鉴定结果，初步鉴定菌株WGBP9为PseudomonasputidabiotypeA中的一株亚种。

4 小结

随着社会的进步和人们生活水平的提高，人们对食品、日用化妆品中天然添加剂的需求越来越高，生物转化法合成茴香酸的研究也逐渐成为热点。反式茴香脑对微生物有一定的抑制性或毒性，因此利用微生物转化反式茴香脑技术的关键在筛选耐受高浓度反式茴香脑及衍生物的菌株。

本研究从环境样品中分离了348株能以反式茴香脑为唯一碳源的菌株。通过薄层层析法和反相高效液相法对发酵产物定量分析进行复筛，最后得到一株对反式茴香脑耐受能力和茴香酸产量都较高菌株WGBP9。在含体积分数为0.5%反式茴香脑的LM9培养基中，30 ℃、转速200 r/min的条件下培养WGBP9 36 h，茴香酸的摩尔生成率为17.9%。WGBF9在种子培养基中能耐受体积分数为20%反式茴香脑，菌体生物量达到空白对照的26.57%，显示该菌株有良好的应用前景。

菌株WGBP9与培养条件优化后的转化反式茴香脑生成茴香酸的菌株BT-13[20]和WGB30[2]相比，茴香酸摩尔生成率有一定差距，但初始条件下WGBP9有较高的茴香酸摩尔生成率(17.9%)，且耐受反式茴香脑的能力更高。因此可以通过发酵条件优化等方法提高WGBP9的茴香酸生成量，或者通过基因改造获取工程菌提高反式茴香脑转化效率。

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(责任编辑 马殷华)

Isolation and Identification of a Strain Capable of Transformingtrans-Anethole to Anisic Acid

WANG Xinyan1，2， SHEN Peihong1，2， HUA Yanfei1，2， LI Junfang1， ZHANG Min1， WU Bo2，3

(1.College of Life Science and Technology， Guangxi University， Nanning Guangxi 530003， China; 2.State Key Laboratory=for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources， Nanning Guangxi 530005， China; 3.College of Biology=and Food Engineering, Guangxi Normal University for Nationalities， Chongzuo Guangxi 532200， China)

After the gradient acclimation and enrichment screening， 348 strains were isolated from environmental samples usingtrans-anethole as the sole carbon source. Through quantitative detection oftrans-anethole and anisic acid with the methods of TLC and RP-HPLC， a strain named WGBF9 with the highest tolerance totrans-anethole and maximum yield of anisic acid was obtained. Biomass of strain WGBF9 was 37.42% of the blank control when the seed culture medium contained 10% (v/v)trans-anethole， and the biomass reached 26.57% in the medium with 20% (v/v)trans-anethole， showing that the strain had a high tolerance to thetrans-anethole. Anisic acid molar generation rate is 17.9%， when the strain was cultured in the screening secondary medium， with rotate speed of 200 r/min， after 36 h fermentation under 30 ℃. WGBF9 was identified as a subspecies ofPseudomonasputidabiotypeA based on the analysis of physiological and biochemical experiments.

Pseudomonasputida;trans-anethole; anisic acid

10.16088/j.issn.1001-6600.2016.04.018

2016-04-19

2016年度广西高等教育创优计划教学相关项目——优势特色专业项目(优质本科专业)；国家重点基础研究发展计划(2010CB126502)

武波(1962—)，男，广西武宣人，广西民族师范学院教授。E-mail： wubogx@gxu.edu.cn

Q93

A

1001-6600(2016)03-0121-08