含靶向性双膦酸基团的乙二胺衍生物的合成及细胞毒活性

孙艳艳，吴希雯，陈 蕾，严 生

（苏州科技大学化学生物与材料工程学院，江苏苏州 215009）

含靶向性双膦酸基团的乙二胺衍生物的合成及细胞毒活性

孙艳艳*，吴希雯，陈 蕾，严 生

（苏州科技大学化学生物与材料工程学院，江苏苏州 215009）

设计并合成一类含靶向性双膦酸基团的N，N’-二乙基乙二胺衍生物，通过元素分析、核磁氢谱、碳谱、磷谱、高分辨质谱对所有化合物进行结构表征，并利用CCK-8试剂盒检测化合物对卵巢癌SKOV3及骨肉瘤MG-63细胞系72h的体外抑制活性，并通过SPSS软件计算IC50值，寻找潜在抗肿瘤先导化合物。

双膦酸；乙二胺；合成；细胞毒活性

双磷酸盐（Bisphosphonates，BPs）是一种人工合成的焦磷酸类似物，BPs结构中的P—C—P键代替焦磷酸中的P—O—P，在生物体内有一定的稳定性，能抑制生物体内焦磷酸酯酶的降解作用，且与骨组织羟基磷灰石表现特殊亲合力，具有骨靶向性[1]。双磷酸盐在抑制骨吸收方面效果显著，用于治疗许多骨相关疾病，包括高血钙症、骨髓瘤、变形性骨炎和骨质疏松等[2]。此外，据报道BPs还有直接或间接的抗肿瘤活性，对乳腺癌、肺癌和骨肉瘤等有较高的抑制活性[3]。双膦酸类药物迄今已经历三代的发展，包括第一代的氯屈膦酸和依替膦酸（不含氮），第二代的帕米膦酸和阿仑膦酸（含氨烷基），和第三代的唑来膦酸和米诺膦酸（含氮杂环），其中唑来膦酸是治疗效果最好的双膦酸类药物，具有高度的骨亲合力及抑制骨吸收活性[4-5]。国内外研究者对双膦酸类药物的结构修饰和筛选取得很大进展，尤其是针对含氨基双膦酸类药物的研究[6-7]。本文设计并合成一类含靶向性双膦酸取代基的N，N’-二乙基乙二胺衍生物，通过核磁、元素分析及高分辨质谱等对化合物进行结构确证，并研究其对卵巢癌及骨肉瘤细胞系的细胞毒活性，这种N，N’-二双膦酸取代的衍生物目前尚未见报道。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

实验用化学试剂均为分析纯，购于国药集团。细胞株培养基均用RPMI-1640。CCK-8试剂盒购于碧云天。核磁共振仪（Bruker Avance III HD 400 MHz），元素分析仪Vario EL（Elementar），液质联用仪（Agilent 6230 Accurate-Mass TOF LC/ MS）。

1.2 化合物的制备

化合物的合成路线如图1所示。M1的制备参考文献报道[8]。0.25mol的M1溶解在1.5mol的85%亚磷酸和120mL氯苯中，加热至100℃，逐滴滴加1mol三氯化磷，搅拌40min，反应剧烈并产生大量黄色固体，继续反应3h，弃掉上清液氯苯，残留液减压蒸馏蒸去溶剂，再加入250mL水，加热回流20 min，再加入少量活性炭回流搅拌15min，过滤，滤液减压浓缩，冷却析出得到粗产物，过滤干燥，用水-丙酮重结晶得到浅黄色固体，即化合物1。化合物2-3的合成路线参考化合物1。数据如下：

化合物1：浅黄色固体（产率35%）。1H NMR（d6-DMSO）：δ 0.90～0.98（t，6H，CH3），1.44～1.52（m，4H，CH2），2.60～2.84（m，6H，NCH and NCH2），6.10～6.18（m，2H，NH），6.60（s，2H，COH），11.90（s，8H，POH）×10-6；13C NMR（d6-DMSO）：δ（10.3，22.8，37.5，54.2，99.5）×10-6；31P NMR（d6-DMSO）：17.20×10-6；HRMS：m/z[M-H]-calcd.for C10H27N2O14P4：523.041 27，found：523.041 78；Anal.calcd for C10H28N2O14P4：C 22.91，H 5.38，N 5.34，found：C 22.96，H 5.32，N 5.38。

化合物2：浅黄色固体（产率42%）。1H NMR（d6-DMSO）：δ 0.92～1.01（t，6H，CH3），1.48～1.60（m，8H，CH2），2.58～2.85（m，6H，NCH and NCH2），6.15～6.24（m，2H，NH），6.55（s，2H，COH），11.85（s，8H，POH）×10-6；13C NMR（d6-DMSO）：δ（10.5，14.0，23.8，40.2，56.6，98.5）×10-6；31P NMR（d6-DMSO）：17.22×10-6；HRMS：m/z[M-H]-calcd.for C12H31N2O14P4：551.072 57，found：551.072 79；Anal.calcd for C12H32N2O14P4：C 26.10，H 5.84，N 5.07，found：C 26.05，H 5.88，N 5.01。

化合物3：浅黄色固体（产率45%）。1H NMR（d6-DMSO）：δ 0.95～1.04（t，6H，CH3），1.41～1.53（m，12H，CH2），2.53～2.80（m，6H，NCH and NCH2），6.12～6.20（m，2H，NH），6.58（s，2H，COH），11.92（s，8H，POH）×10-6；13C NMR（d6-DMSO）：δ（9.2，10.8，23.0，25.7，42.0，57.5，97.9）×10-6；31P NMR（d6-DMSO）：17.24 ppm；HRMS：m/z[M-H]-calcd.for C14H35N2O14P4：579.103 87，found：579.103 25；Anal.calcd for C14H36N2O14P4：C 28.97，H 6.25，N 4.83，found：C 28.93，H 6.29，N 4.80。

图1 化合物1-3的合成

1.3 生物活性测试

以唑来膦酸为阳性对照，利用CCK-8法检测化合物对卵巢癌和骨肉瘤细胞系的细胞毒活性，实验步骤参考文献[9]，取对数生长期的肿瘤细胞计数，培养基稀释后接种于96孔培养板内，每孔100μL细胞液，浓度约为3×104个/mL。过夜培养（5%CO2，37℃），待细胞贴壁后进行给药，分别设给药组，阳性对照组和阴性对照组。待测化合物用超纯水溶解，临用前用细胞培养基稀释成7个浓度梯度。加药后培养72h，加10 μL的CCK-8溶液（5 mg/mL），37℃孵育4h。用酶标仪在450nm波长下测定每孔OD值，并计算抑制率，通过SPSS软件计算IC50值（半数抑制浓度）。

2 结果与讨论

以N，N’-二乙基乙二胺与氯乙酸为原料，氢氧化铝为缚酸剂制备中间体M1，再与亚磷酸和三氯化磷进行磷酸化反应得到化合物1，其他化合物的制备参考化合物1的制备方法，如图1所示。所有化合物均通过核磁共振氢谱、碳谱、磷谱、元素分析及高分辨质谱进行表征，结构与谱图数据一致。

通过CCK-8细胞毒活性测试试剂盒，检测化合物1-3与阳性对照唑来膦酸对卵巢癌SKOV3及骨肉瘤MG-63细胞株的体外细胞毒活性，结果如表1所示。从表1数据可知，化合物1-3对SKOV3的IC50值大于100μM，唑来膦酸的IC50值为28.3μM，表明化合物1-3对SKOV3的细胞毒活性低于阳性对照唑来膦酸；化合物1和2对MG-63的IC50值分别为48.7 μM和53.5μM，唑来膦酸的IC50值为17.5μM，说明1和2对MG-63的细胞毒活性高于化合物3，但低于阳性对照唑来膦酸。整体而言，化合物1和2对MG-63的细胞毒活性比SKOV3较高，但均低于阳性对照。

3 结论

本文设计并合成了一类含双膦酸基团的N，N’-二乙基乙二胺衍生物，并研究其对卵巢癌及骨肉瘤细胞系的体外抑制活性。通过实验结果可知，化合物1-2对骨肉瘤MG-63的细胞毒活性比卵巢癌SKOV3较高，但低于阳性对照唑来膦酸。实验结果为后续双膦酸化合物的结构改造提供依据。

Synthesis and Cytotoxicity of Ethylenediamine Derivatives with Bone-targeting Bisphosphonate Groups

Sun Yan-yan，Wu Xi-wen，Chen Lei，Yan Sheng

A novel series of N，N’-diethylethylenediamine derivatives containing N，N’-dibisphosphonate substituents have been synthesized and characterized by elemental analysis，1H NMR，13C NMR，31P NMR and HRMS spectra.The in vitro cytotoxicities of all compounds were tested with CCK-8 by WST-8 assay against SKOV3 and MG-63 cell lines after 72 h incubation and the IC50 values were obtained by SPSS software.

bisphosphonate；ethylenediamine；synthesis；cytotoxicity

R914

B

1003–6490（2016）10–0101–02

2016–09–15

国家自然科学基金青年项目（21401137），苏州市“高等院校、科研院所紧缺高层次人才”引进资助项目，江苏省大学生创新创业训练计划项目（201510332057X）。

孙艳艳（1985—），女，河南武陟人，讲师，主要研究方向为药物化学。