载荷对椎间盘退变影响的在体动物实验模型研究进展

夏冬冬 综述, 谭 军 审校

(同济大学附属东方医院脊柱外科,上海 200120)



·综 述·

载荷对椎间盘退变影响的在体动物实验模型研究进展

夏冬冬 综述, 谭 军 审校

(同济大学附属东方医院脊柱外科,上海 200120)

载荷与椎间盘退变之间的关系是研究椎间盘退变机制具的关键点,而设计制造合适的加载装置在动物体内进行加载实验对深入研究和探索载荷与椎间盘退变之间的关系十分重要。本文综述了国内外利用活体实验动物研探索载荷对椎间盘影响的研究,并且评价了各种在体动物模型的特点和优缺点,可以为研究载荷与椎间盘退变关系的研究者在动物模型的选择上提供一定的参考和帮助。

载荷； 加载装置； 椎间盘退变； 动物实验

椎间盘是人类脊柱的重要组成部分,功能是吸收、缓冲和传递人体所受的载荷,它的存在使得脊柱可以在一定范围内活动[1]。椎间盘的退变往往会造成功能紊乱甚至功能丧失,还会引起腰椎间盘突出症、椎间盘源性腰痛和颈椎病等脊柱退行性疾病,严重影响患者的生活质量,给家庭和社会造成了巨大的经济负担。研究[2]发现超出生理范围的轴向压缩可以明确引起椎间盘的退变,由此提出了以机械载荷因素为始动因素而致使椎间盘退变的概念,即椎间盘的非生理性负荷诱导椎间盘结构损害和一系列细胞介导的不可逆性反应,而这些变化可进一步通过营养代谢通路的薄弱,年龄的增长、修复机制的不完善以及遗传因素等加深椎间盘的退变,由此明确了载荷与椎间盘退变存在着密切的关系。为了进一步明确载荷和椎间盘退变之间的关系,研究者们陆续建立各种活体动物模型,这些动物模型因为实验设计的不同,各有其各自的特点。本文综述各种动物模型的特点,并且探讨不同载荷对椎间盘的影响。

1 动物模型和加载装置

在体动物实验是研究椎间盘退变和载荷之间关系的一个重要手段,它可以全面地反映出在多种生理因素的存在条件下载荷因素对实验动物的作用,通过在体实验得出的数据往往和人类的更为贴近。然而利用在体动物研究载荷与椎间盘退变的关系的一大难点便是如何制作一个既能产生实验需要的载荷又能植入实验动物体内,但却对实验动物产生最小伤害的加载装置。由于实验动物的大小和其椎间盘退变周期等因素的限制,目前用于体研究椎间盘退变与载荷在体实验常用的实验动物往往是大鼠、小鼠和兔这一类的小型动物。

研究[3-6]均报道过使用弹簧加载装置对大鼠尾椎进行加压。Iatridis等[3]对第8～10尾椎持续加压56d,压力相当于33%、67%、100%动物自体体质量,结果受压椎间盘生物力学特性、椎间盘内生物化学成分改变。MacLean等[7]使用液压驱动器对大鼠第8/9尾椎以1MPa的压力动态加压2h,频率0.2Hz,结果动态压缩致使椎间盘的基因表达改变。Wuertz等[8]使用气动加载装置对大鼠第8/9尾椎动态加压,均以1Hz的频率加压1MPa,其中持续56d,每天8h的动态加载组可以发现椎间盘有明显的退变迹象。Ching等[9]进行了对大鼠第6/7尾椎穿椎体针加压产力的研究,结果发现持续压缩使椎间盘蛋白聚糖含量下降,而动态压缩则没有变化。Barbir等[10]对大鼠第8/9尾椎用步进电机进行扭转,分为动态扭转组和持续扭转组,前者又分为±5°、±15°及±30°进行1Hz的频率扭转90min,后者为±30°持续扭转90min,结果发现当扭转角度为±30°时，TNF-α和IL-1β表达上调。Kim等[11]用弹簧产力装置对大鼠第5/6尾椎产生4N的剪切力,结果发现剪切力使相关节段椎间盘发生了明显的退变。Lotz等[12-13]、Papuga等[14]用悬臂弹簧和橡皮筋产力对小鼠第9/10尾椎持续压缩7d,发现椎间盘的退变情况与加载应力的大小和时间相关。Walsh等[2]用乳胶球囊充气产力的方式对小鼠第10/11尾椎进行加压,结果发现0.9MPa、0.1Hz下的载荷对椎间盘没有影响,而过低加载频率或过大的载荷越可致使椎间盘退变。Hutton等[15]用弹簧产力的方式对狗的第1/2、3/4腰椎节段持续加压17～27周,压力为70～250N,结果发现压力越大时间越长退变效果越明显。Kroeber等[16-17]、Hee等[18]、Guehring等[19]、熊蠡茗等[20]均使用过弹簧装置对兔的腰椎进行加压研究,其中Kroeber等[16-17]对兔的第4/5腰椎以2.4MPa压强持续加压28d,结果发现兔第4/5腰椎间盘发生明显退变。

1.1 大鼠

由于大鼠尾部的椎间体易于安装各种实验装置,所以大鼠是最常被用于在体研究椎间盘退变与载荷之间关系的实验动物。Iatridis等[3]通过在大鼠第8、10椎椎体各打入两根直径为0.7mm的不锈钢针,将两个金属环固定在大鼠的第8、10尾椎椎体上,通过连接两钢环的螺钉上放置弹簧来对该节段的椎体进行压缩应力加载,其称之为lizarov-type加载装置。此加载装置很好地利用了大鼠尾部椎体的解剖学结构的特点,巧妙地将穿椎体钢针把金属环固定在相应实验椎体上,从而可以单独地控制所需加载的节段。此外这个装置还可以通过调整过两个金属环之间的螺钉长度而对相应加载节段形成一定角度的弯曲,在对相应节段进行轴向地压缩的同时还可以进行有一定弯曲角度地压缩。但是该装置由于单纯依靠弹簧产力,存在一个加载时无法随时检测和控制载荷大小缺点,而椎间盘的受力则是一个动态变化的过程。于是在lizarov-type加载装置的基础上,许多研究者在产力方式上对该装置进行了改进。MacLean等[7]采用液压驱动器作为加载装置的动力,其可以产生准确且有一定变化的载荷。但是这种外接液压驱动器作为动力的加载装置本身比较复杂,并且需要将大鼠麻醉后固定在某个体位再实施实验。Wuertz等[8]所设计的实验装置则克服了这些问题,其利用气动加载装置产力,该装置只需要在加载装置外接一根导线即可对加载装置提供加载的可控动力。使用该装置在实验过程中不需要将实验动物麻醉固定便可以根据实验需要对实验节段的椎间盘产生可控的压缩加载。

以上在以大鼠作为实验动物的椎间盘加载装置几乎都只提供压缩加载,而Barbir等[10]设计的加载装置则把重点放在了扭转加载对椎间盘退变的作用上。其设计的加载装置可以以一定频率(1Hz)和一定角度(±5°、±15°、±30°)对实验节段的椎间盘进行一定扭应力的加载。Kim等[11]创造性地在大鼠腰椎上发明了加载纯剪切力的装置,探索了单一剪切力加载与椎间盘退变之间的关系。虽然该装置还存在着一些不足,但该装置改变了传统上只重视研究单一压缩对椎间盘的作用的情况,为研究多方面应力作用与椎间盘退变之间的关系扩展了思路。

1.2 小鼠

在小鼠上所设计的加载装置与大鼠的较为相似,所不同的是由于小鼠的体积明显小于大鼠,故而为加载小鼠椎间盘的所设计的加载装置需要一定的精细程度。由于小鼠的椎体大小的限制,研究者往往仅用一根钢针打入小鼠的椎体来固定加载装置并传递加载装置所产生的力。Papuga等[14]在研究慢性持续的轴向压缩与小鼠尾椎椎间盘与椎体变化关系时，压缩装置采用了上述的单钢针固定,同时其采用较为经典的弹簧压缩持续给力的方式。这种加载装置的思路与众多运用于大鼠的加载装置设计思路相似,其制作简单、压缩效果较好,但是弹簧产力的不准确性和通过单钢针传导载荷的不均一性仍是其较难克服的问题。相对于上述的装置,Walsh等[2]所设计的加载装置虽然依然使用单钢针地固定方式,但其在产生载荷的方式做出了一定的改进,其通过向位于加载装置一段的橡胶球囊充气从而获得可控的压力对相应椎间盘节段进行压缩加载。该种仪器的设计,使得对小鼠椎间盘产生可控、可变的加载成为可能。

1.3 狗

研究[21]显示,狗椎间盘的组织特性较接近于人类椎间盘,故而较早前就有狗脊柱上放置加载装置来研究压缩载荷与椎间盘退变之间的关系。Hutton等[15]在狗的腰椎打入不锈钢螺丝在螺丝的尾端连接弹簧,对相应节段椎间盘施加60～250N的压缩力。该装置仅仅包含产力的弹簧与使之固定于动物椎体的螺钉,其设计简单并且有效地使相应节段椎间盘受到持续的压缩力加载。Hutton等[22]在随后的研究中指出，该加载装置在压缩相应节段椎间盘的同时却没有限制相应节段的活动性,使得相应节段的椎间盘的营养供给等环节几乎未受到压力加载的影响。之后的研究几乎没有再应用该加载装置,也很少有活体椎间盘加载的实验使用实验动物狗。

1.4 兔

实验动物兔也常被用于研究载荷与椎间盘退变之间的关系。Kroeber等[16]在兔L4、L5打入直径为1.5mm的克氏针将装有弹簧的加载装置固定于兔的背部。通过该加载装置，Kroeber等[16]对兔腰4/5椎间盘进行了28d的载荷为2.4MPA的压缩,并在相应椎间盘发现了明显的退变表现。该装置的固定、加载方式与应用于大鼠的经典加载装置极为相似,也存在着相似的不足,即载荷种类过于单一仅为单纯的压缩。随后的研究中,Kroeber等[17]创造性地改变的瘫痪的位置,使原本只能产生压缩载荷的加载装置变成了产生拉伸作用的装置,并且成功地证明了一定的拉伸作用可以使已退变的椎间盘组织发生重建作用。此后在研究载荷和椎间盘之间关系时多次使用了类此的加载装置[18-20]。

2 不同的载荷类型对椎间盘的作用

在研究椎间盘退变的动物试验中设计制造加载装置是为了研究不同类型的载荷与椎间盘退变之间的关系,而设计制造加载装置最根本也就是为了制造目的类型的载荷。研究[23[3，8，10，12-16，18-21]、动态压缩[2，4-5，19]、持续拉伸[13]、持续扭转[6]、动态扭转[6]和持续剪切[7]。

2.1 压缩载荷

压缩载荷是椎间盘所承受的最主要的载荷,也是目前研究最为广泛的载荷类型。体外实验[24]显示，一定的压缩载荷可以导致椎间盘内细胞的死亡和成分的改变。在活体实验中,为了证实压缩载荷与椎间盘退变之间的关系,研究者们开始探索可以固定于动物体内的加载装置。到目前为止,研究者们采用最多是一种包含弹簧作为产力源的加载装置,虽然运用于各种实验动物的有着不同大小、外观的加载装置,但是其最核心的部分还是弹簧。从Hutton等[15]最初只有简单的螺丝加弹簧的组合,到Kroeber等[16]可控的压缩加载装置,其基本原理都是预先改变装置内弹簧的长度,然后固定于实验节段,从而产生持续的压缩作用。通过椎间盘的高度变化,髓核和终板的组织学改变,椎间盘细胞的和基因水平的变化证实轴向压缩可以引起兔椎间盘的退变。这种依靠弹簧的装置虽然构造简单、操作便当而且经济,但是对于压缩力大小的控制性却是一个难以克服的问题,众所周知弹簧形变到一定程度、一定时间其准确性就会下降,难以保证实验条件的准确性。除此之外单单依靠弹簧产力的加载装置仅仅只能提供单一不可变化的压缩载荷。一些以气动加载装置[8]等高科技的外在加载动力源的引入,成功地解决了这些问题。不但如此,由于这些动力源对其产生的载荷具有可控性故而使得产生可控大小、可控时长的压缩载荷成为可能。

2.2 其他载荷

除了压缩载荷,研究者们还研究了拉伸、扭转和剪切载荷与椎间盘退变之间的关系,并且发明了相关的实验装置。研究[25]表明，牵引椎体对椎间盘的重建具有积极的作用,故而研制出一种能产生拉伸作用的加载装置应用于活体动物实验是非常有必要的。研究[17]对其原有的压缩装置进行改造,使之可以产生可控的拉伸载荷。关于扭转和剪切载荷与椎间盘退变之间的关系的研究比较不多见,但也有研究者研制了相关的加载装置,这些加载装置的研究,为多角度探索载荷与椎间盘退变之间关系的研究成为可能。

3 结 语

椎间盘是脊柱中的非骨性部分,其由终板、纤维环和髓核构成。终板连接椎间盘于上下椎体,通过渗透作用为椎间盘提供营养,通过形变可以部分缓冲脊柱所受的载荷并传递给相邻椎间盘[26]。纤维环有弹性胶原纤维构成,其包绕着髓核,并连接于上下终板。髓核位于椎间盘的中央是椎间盘的重要组成部分,因为其富含水分具有较大的形变能力,故在吸收、缓冲和传递脊柱所受的载荷的过程中发挥着重要的作用。在日常活动中,椎间盘经受着不同种类和大小的载荷,这些载荷对椎间盘的新陈代谢和组织健康的维持有着重要的作用。研究发现一定大小、频率和时长的载荷加载对维持椎间盘内基质的平衡具有非常关键的作用[8]。而过大的载荷可通过影响椎间盘的营养供给和基质代谢从而导致椎间盘的退变[27]。故而在实验动物上建立相关模型研究载荷与椎间盘退退变之间的关系就显得尤为的重要,其中为了实验需求而设计的加载装置更是在整个实验中起着不可替代的作用。一个好的加载装置需要具有以下特点: 结构简单、操作简易并且可以有效的固定于实验动物体内；加载装置需要有稳定、可靠并且可调的动力源；能准确产生实验计划中所设定的加载条件；加载装置的植入要尽量减小对活体实验动物的创伤,使得手术创伤对实验结果的影响最小化；尽量不影响实验动物的日常活动。

目前,植入加载装置的活体实验动物的选择往往都是一些例如大鼠、小鼠和兔之类的小型实验动物,而有研究[28]显示一些大型的实验动物例如猪的脊柱结构和特性和人类的更为贴近。因此,设计出能产生多种载荷类型并且可应用于大型实验动物的活体实验的加载装置是今后努力的方向。

[1] Adams MA, Roughley PJ. What is intervertebral disc degeneration, and what causes it?[J]. Spine (Phila Pa 1976),2006,31(18): 2151-2161.

[2] Walsh AJ, Lotz JC. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading[J]. J Biomech, 2004,37(3): 329-337.

[3] Iatridis JC, Mente PL, Stokes IA, et al. Compression-induced changes in intervertebral disc properties in a rat tail model[J]. Spine (Phila Pa 1976),1999,24(10): 996-1002.

[4] Yurube T, Takada T, Hirata H, et al. Modified house-keeping gene expression in a rat tail compression loading-induced disc degeneration model[J]. J Orthop Res, 2011,29(8): 1284-1290.

[5] Yurube T, Nishida K, Suzuki T, et al. Matrix metalloproteinase (MMP)-3 gene up-regulation in a rat tail compression loading-induced disc degeneration model[J]. J Orthop Res, 2010,28(8): 1026-1032.

[6] Lai A, Chow DH, Siu SW, et al. Effects of static compression with different loading magnitudes and durations on the intervertebral disc: aninvivorat-tail study[J]. Spine (Phila Pa 1976),2008,33(25): 2721- 2727.

[7] MacLean JJ, Lee CR, Grad S, et al. Effects of immobilization and dynamic compression on intervertebral disc cell gene expressioninvivo[J]. Spine (Phila Pa 1976),2003,28(10): 973-981.

[8] Wuertz K, Godburn K, MacLean JJ, et al.Invivoremodeling of intervertebral discs in response to short- and long-term dynamic compression[J]. J Orthop Res, 2009,27(9)： 1235-1242.

[9] Ching CT, Chow DH, Yao FY, et al. Changes in nuclear composition following cyclic compression of the intervertebral disc in aninvivorat-tail model[J]. Med Eng Phys, 2004,26(7): 587-594.

[10] Barbir A, Godburn KE, Michalek AJ, et al. Effects of torsion on intervertebral disc gene expression and biomechanics, using a rat tail model[J]. Spine (Phila Pa 1976),2011,36(8): 607-614.

[11] Kim J, Yang SJ, Kim H, et al. Effect of shear force on intervertebral disc (IVD) degeneration: aninvivorat study[J]. Ann Biomed Eng, 2012,40(9): 1996-2004.

[12] Lotz JC, Colliou OK, Chin JR, et al. Compression-induced degeneration of the intervertebral disc: aninvivomouse model and finite-element study[J]. Spine (Phila Pa 1976),1998,23(23): 2493-2506.

[13] Lotz JC, Chin JR. Intervertebral disc cell death is dependent on the magnitude and duration of spinal loading[J]. Spine (Phila Pa 1976),2000,25(12): 1477-1483.

[14] Papuga MO, Proulx ST, Kwok E, et al. Chronic axial compression of the mouse tail segment induces MRI bone marrow edema changes that correlate with increased marrow vasculature and cellularity[J]. J Orthop Res, 2010,28(9): 1220-1228.

[15] Hutton WC, Toribatake Y, Elmer WA, et al. The effect of compressive force applied to the intervertebral disc in vivo. A study of proteoglycans and collagen[J]. Spine (Phila Pa 1976),1998,23(23): 2524-2537.

[16] Kroeber MW, Unglaub F, Wang H, et al. New in vivo animal model to create intervertebral disc degeneration and to investigate the effects of therapeutic strategies to stimulate disc regeneration[J]. Spine (Phila Pa 1976),2002,27(23): 2684-2690.

[17] Kroeber M, Unglaub F, Guehring T, et al. Effects of controlled dynamic disc distraction on degenerated intervertebral discs: aninvivostudy on the rabbit lumbar spine model[J]. Spine (Phila Pa 1976),2005,30(2): 181-187.

[18] Hee HT, Chuah YJ, Tan BH, et al. Vascularization and morphological changes of the endplate after axial compression and distraction of the intervertebral disc[J]. Spine (Phila Pa 1976),2011,36(7): 505-511.

[19] Guehring T, Nerlich A, Kroeber M, et al. Sensitivity of notochordal disc cells to mechanical loading: an experimental animal study[J]. Eur Spine J, 2010,19(1): 113-121.

[20] 熊蠡茗,邵增务,郭兵,等.可控轴向压力致兔腰椎间盘退变模型的建立及评价[J].中国矫形外科杂志,2009,17(19): 1492-1496.

[21] Bergknut N, Rutges JP, Kranenburg HJ, et al. The dog as an animal model for intervertebral disc degeneration?[J]. Spine (Phila Pa 1976),2012,37(5): 351-358.

[22] Hutton WC, Ganey TM, Elmer WA, et al. Does long-term compressive loading on the intervertebral disc cause degeneration?[J]. Spine (Phila Pa 1976),2000,25(23): 2993-3004.

[23] Chan SC, Ferguson SJ, Gantenbein-Ritter B. The effects of dynamic loading on the intervertebral disc[J]. Eur Spine J, 2011,20(11): 1796-1812.

[24] Walter BA, Korecki CL, Purmessur D, et al. Complex loading affects intervertebral disc mechanics and biology[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2011,19(8): 1011-1018.

[25] Hee HT, Zhang J, Wong HK. Effects of cyclic dynamic tensile strain on previously compressed inner annulus fibrosus and nucleus pulposus cells of human intervertebral disc-aninvitrostudy[J]. J Orthop Res, 2010,28(4): 503-509.

[26] Moore RJ. The vertebral end-plate: what do we know?[J]. Eur Spine J, 2000,9(2): 92-96.

[27] 顾韬,阮狄克.生物力学因素对椎间盘退变的影响及机理[J].中国脊柱脊髓杂志,2011,21(6): 523-526.

[28] Sheng SR, Wang XY, Xu HZ, et al. Anatomy of large animal spines and its comparison to the human spine: a systematic review[J]. Eur Spine J, 2010,19(1): 46-56.

Loading device in animal model for study of mechanism of intervertebral disc degeneration

XIADong-dong,TANJun

(Dept. of Orthopedic Surgery, East Hospital, Tongji University, Shanghai 200120， China)

Compression loading may induce intervertebral disc degeneration (IDD), and the development of a proper loading device in animal model is essential for study of the mechanism of IDD. This article will describe a variety of loading devices used in different animal models in vivo, and discuss their characteristics and advantages.

loading； loading device； intervertebral disc degeneration； animal experiment

10.16118/j.1008-0392.2016.01.025

2015-03-09

上海市浦东新区学科带头人计划(PWRd-2011-02)

夏冬冬(1987—),男,博士研究生.E-mail: xiadongdong@qq.com

谭 军.E-mail: dr.tan@139.com

R 681.5+3

A

1008-0392(2016)01-0115-05