胃黏膜组织中恶臭假单胞菌临床意义的探讨

印 琳，刘 芳，郭长城，王 琼，杨 杰，潘 科，潘 晨，熊 妍，陈颖婷，方 文，陈峥宏

胃黏膜组织中恶臭假单胞菌临床意义的探讨

印 琳1，2，刘 芳2，郭长城2，王 琼2，杨 杰3，潘 科4，潘 晨3，熊 妍5，陈颖婷3，方 文1，陈峥宏2

目的 探索恶臭假单胞菌在幽门螺杆菌感染相关胃肠疾病中的意义。方法采集14C尿素呼气试验阳性患者病变胃黏膜354例，进行细菌的分离培养。根据菌落形态、革兰染色、尿素酶试验及幽门螺杆菌特异性16S rRNA基因片段的PCR进行幽门螺杆菌的鉴定，同时提取胃黏膜组织DNA，通过幽门螺杆菌特异性PCR进行快速诊断。将非幽门螺杆菌转种于营养琼脂培养基，进行快速尿素酶试验。尿素酶阳性的非幽门螺杆菌染色体DNA利用细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增、测序及序列比对。使用全自动细菌鉴定仪对经测序比对为恶臭假单胞菌的菌株进行鉴定。采用K-B纸片扩散法进行药物敏感性试验。结果从354例样本中分离出革兰阴性、尿素酶阳性的恶臭假单胞菌10株，经16S rRNA基因测序和序列比对，与GenBank中恶臭假单胞菌的相似性≥98%。10株恶臭假单胞菌的胃黏膜标本中，6例标本幽门螺杆菌特异性PCR为阳性，4例为阴性。传代存活的7株恶臭假单胞菌的K-B法药物敏感试验显示对左氧氟沙星均敏感，1株对四环素敏感， 5株对阿莫西林耐药，6株对克拉霉素耐药，7株对甲硝唑、氨苄青霉素均耐药。7株菌经全自动细菌生化鉴定仪鉴定结果均为恶臭假单胞菌。结论病变胃黏膜中分离出尿素酶阳性且对治疗幽门螺杆菌感染的多种抗生素耐药；可能造成临床上14C-尿素呼气试验假阳性，并继发感染影响胃肠疾病的进展。

恶臭假单胞菌；培养；尿素酶；16S rRNA；耐药性

恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)是一种革兰阴性杆菌，有些菌株为卵圆形，单端丛毛菌，运动活泼。恶臭假单胞菌为鱼的一种致病菌，常从腐败的鱼中检出，可作为人类咽部的正常菌群，是人类少见的条件致病菌，偶从人类尿道感染、皮肤感染和骨髓炎标本中分离出[1]。

Yoshino Y等报道，恶臭假单胞菌是一种低毒机会性致病原，原发性感染可致免疫功能低下和使用医疗设备(或导尿管)病人的院内感染[2-3]。Souza Dias MB等报道，因输血或输液感染暴发恶臭假单胞菌菌血症[4]。研究报道肺炎、扁桃体炎、导管相关性血源性感染、急性胆囊炎和胆管炎、血栓性静脉炎和皮肤软组织炎症(SSTI)等可致恶臭假单胞菌菌血症[5-7]，甚至引发多器官衰竭并导致死亡[5]。

我们在对胃、十二指肠患者病变胃黏膜进行幽门螺杆菌(H.pylori)分离培养时发现，病变胃黏膜中存在对治疗幽门螺杆菌的抗生素耐药，并且是尿素酶阳性的非幽门螺杆菌，经细菌16S rRNA基因的PCR及测序确定为恶臭假单胞菌，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源 病变胃黏膜来源于2015年3月至2015年12月，因上消化道不适症状就诊于贵州医科大学附属医院、贵州医科大学附属白云医院、贵阳市儿童医院、黔南布依族苗族自治州人民医院内镜室，14C-尿素呼气试验阳性、胃镜检查有病变的患者354例。患者术前6～8 h禁饮禁食，手术用的胃镜经过严格洗涤消毒处理。无痛胃镜状态下，对于内窥镜下观察有病变的胃黏膜，使用一次性活检钳采集病灶旁组织1块。标本采集取得病人知情同意，实验方案通过贵州医科大学附属医院医学伦理委员会审查。

1.1.2 培养基 营养琼脂培养基(上海博微生物科技有限公司)；MH琼脂培养基(杭州滨和微生物试剂有限公司)；选择性培养基：MH血琼脂培养基(含10%无菌脱纤维羊血和幽门螺杆菌选择性添加剂[英国，OXOID，含万古霉素5.0 mg，头孢磺啶2.5 mg，甲氧苄氨嘧啶2.5 mg，两性霉素B 2.5 mg])。

1.1.3 其他材料：微需氧产气袋(日本，三菱化学株式会社)、快速尿素酶试纸(珠海市克迪科技开发有限公司)、革兰染色液(青岛海博生物技术有限公司)、细菌基因组DNA提取试剂盒(生工生物工程上海股份有限公司)、血液组织细胞基因组DNA提取试剂盒和DNA Marker Ⅶ(北京天根生化科技有限公司)、细菌16S rRNA基因通用引物(27F;1492R)和幽门螺杆菌16S rRNA基因特异性引物(上海英骏生物技术有限公司合成)。药敏纸片(购自杭州滨和微生物试剂有限公司)：阿莫西林；克拉霉素；甲硝唑；左氧氟沙星；四环素；氨苄青霉素。高速台式离心机TGL-16B(上海安亭科学仪器厂)；数显隔水式培养箱303AB-4型(武汉精华科教仪器有限公司)；PCR扩增仪(杭州晶格科学仪器有限公司)。贵州省人民医院中心实验室BD PhoenixTM-100全自动细菌鉴定/药敏系统。

1.2 方法

1.2.1 恶臭假单胞菌的分离和鉴定 354例疑为幽门螺杆菌感染的胃黏膜样本参考文献[8]进行幽门螺杆菌的分离培养，根据菌落形态、革兰染色、尿素酶试验以及幽门螺杆菌特异性16S rRNA基因片段的PCR进行鉴定，区分幽门螺杆菌和非幽门螺杆菌。将非幽门螺杆菌转种于营养琼脂培养基，37 ℃需养培养18～24 h后，以尿素酶试纸进行快速尿素酶试验。

取尿素酶阳性的细菌单菌落以细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌染色体DNA，利用细菌16S rRNA基因的通用引物(27F；1492R)[9]进行PCR扩增，纯化的PCR产物由生工生物工程上海有限公司(Sangon Biotech)采用Sanger法进行测序，测序结果在GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行序列比对，以鉴定菌种。

1.2.2 病变组织中幽门螺杆菌16S rRNA基因片段的PCR扩增：将100 μL患者病变黏膜组织悬液用DNA提取试剂盒提取组织及组织中细菌的DNA，通过幽门螺杆菌特异性16S rRNA 基因片段PCR进行幽门螺杆菌感染的快速诊断[10]。

1.2.3 药物敏感性试验 参照WHO推荐的K-B纸片扩散法，测定经16S rRNA基因序列比对鉴定为恶臭假单胞菌的单菌落培养物对甲硝唑(5 μg/片)、氨苄青霉素(10 μg/片)、阿莫西林(10 μg/片)、克拉霉素(15 μg/片)、左氧氟沙星(5 μg/片)、四环素(30 μg/片)6种药物的药物敏感性。0.85%生理盐水制备0.5麦氏单位菌悬液，吸取100 μL菌悬液均匀涂布于MH平板表面，无菌操作将药敏纸片贴于琼脂平板上。37 ℃培养18～24 h后测量药敏纸片抑菌圈直径。药敏试验依据美国CLSI《抗菌药物敏感性试验指南》标准进行结果判断[11]。

1.2.4 恶臭假单胞菌的全自动生化鉴定 将复苏成功的经NCBI序列比对为恶臭假单胞菌的7株菌送至贵州省人民医院中心实验室，使用BD PhoenixTM-100全自动细菌鉴定/药敏系统进行细菌生化鉴定。

2 结 果

2.1 恶臭假单胞菌的分离和鉴定 从354例胃黏膜样本中共分离获得10株恶臭假单胞菌，为革兰阴性杆菌(或球杆菌)，尿素酶试验阳性。以细菌16S rRNA基因的通用引物进行PCR，10株菌的扩增产物均为1 465 bp(见图1)，经测序及序列比对，与数据库中恶臭假单胞菌16S rRNA基因序列的一致性最高，均高于98%。该10例样本幽门螺杆菌分离培养结果及临床诊断见表1。

M: DNA markerⅦ；泳道1-10:10株分离自胃黏膜的恶臭假单胞菌PCR产物；泳道11: 阴性对照(ddH2O)；泳道12:阳性对照(H.pylori NCTC 11637)M: DNA Marker Ⅶ; Lane 1-10: PCR products of 10 strains Pseudomonas putida isolated from gastric mucosa tissue; Lane 11: Negative control (ddH2O); Lane 12: Positive control (H. pylori NCTC 11637).图1 10株恶臭假单胞菌利用细菌16S rRNA基因通用引物PCR扩增结果Fig．1 PCR amplification of 10 strains Pseudomonas putida by general primers of bacterial 16S rRNA gene

2.2 胃黏膜组织进行幽门螺杆菌特异性PCR快速诊断结果 10例分离出恶臭假单胞菌的胃黏膜标本均未培养出幽门螺杆菌，有6例组织标本的幽门螺杆菌特异性PCR结果为阳性，4例标本为阴性，见表1。

2.3 恶臭假单胞菌的K-B法药敏检测结果 由于传代保种中死亡，有3株菌未做药敏试验，存活的7株菌对左氧氟沙星均敏感，对四环素1株敏感，但对甲硝唑、氨苄青霉素均耐药，对阿莫西林、克拉霉素多为耐药，见表2。

2.4 全自动细菌生化鉴定及药敏试验结果 7株传代存活的菌株经BD PhoenixTM-100全自动细菌鉴定仪鉴定为恶臭假单胞菌。细菌生化反应见表3。

3 讨 论

低胃酸(pH<4)通常被认为是一个防止胃内微生物过度生长的有效杀菌屏障[12]，并且胃内胆汁酸的反流，较厚的粘液层和胃的蠕动等因素都不适宜于细菌的定植。同时，唾液和食物中由口腔内乳酸杆菌转化硝酸盐形成的亚硝酸盐在胃液作用下产生的一氧化氮，也参与上消化道的先天性防御。因此过去长期认为“胃是无菌器官”[13-14]。直至1982年，Barry Marshall 和Robin Warren发现幽门螺杆菌，并指出幽门螺杆菌与胃炎、胃溃疡、胃癌、胃黏膜相关性淋巴样组织淋巴瘤的相关性(MALT)[15]，彻底颠覆胃内无菌的传统观点。

表1 10株恶臭假单胞菌培养及鉴定一般情况

Tab.1 General culture and identification information of 10 strains P. putida

标本编号Specimenserialnumber革兰染色Gramsstaining尿素酶试验Ureasetest胃黏膜组织的H．pylori特异性PCRH．pylorispecificPCRofgastricmucusatissueH．pylori培养结果H．pyloriculture临床诊断ClinicaldiagnosisG16G-球杆菌G-coccobacillus+--慢性非萎缩性胃炎Chronicnon⁃atrophicgastritisG45G-球杆菌G-coccobacillus++-胃角溃疡A1-H1期；慢性非萎缩性胃炎Gastricangleulcer(A1-H1phases)；Chronicnon⁃atrophicgastritiswithgas⁃tricantrumerosionG47G-短杆菌G-bacillusbrevis+--慢性非萎缩性胃炎伴幽门前区浅溃疡A2期Chronicnon⁃atrophicgastritiswithprepyloriculcer(A2phase)G79G-球杆菌G-coccobacillus+--慢性非萎缩性胃炎Chronicnon⁃atrophicgastritisG88G-球杆菌G-coccobacillus++-胃窦溃疡H1期；慢性非萎缩性胃炎Gastricantrumulcer(H1phase)；Chronicnon⁃atrophicgastritisD210G-短杆菌G-bacillusbrevis++-慢性胃炎ChronicgastritisD217G-短杆菌G-bacillusbrevis++-慢性胃炎；十二指肠息肉Chronicgastritis；DuodenalpolypsD228G-短杆菌G-bacillusbrevis++-全胃炎AllgastritisD230G-短杆菌G-bacillusbrevis++-胃多发性溃疡MultiplegastriculcerD256G-短杆菌G-bacillusbrevis+--慢性胃炎Chronicgastritis

注：“+”为阳性，“-”为阴性

Note：＂+＂is positive； ＂-＂is negative

表2 7株恶臭假单胞菌K-B法药敏检测结果Tab．2 Antibiotic susceptibility of 7 strains of P. putida

药物名称Nameofantibiotics菌株数(n)No．ofstrains敏感株(n)No．ofsusceptiblestrains中介(n)No．ofintermediatestrains耐药株(n)No．ofresistantstrains甲硝唑metronidazole7007氨苄青霉素Ampicillin7007阿莫西林amoxicillin7025克拉霉素clarithromycin7016四环素tetracycline7160左氧氟沙星levofloxacin7700

表3 7株非幽门螺杆菌的生化鉴定结果Tab．3 Biochemical identification results of 7 non-H.pylori strains

Oxidase+L．Gamma．Glutamyl．p．Nitroanilid+Arginine⁃Arginine-L．Proline．p．Nitroanilide+Glycine⁃Proline-p．Nitrophenyl．B．D．Glucoside-Glycine-Bis[p．Nitrophenyl]Phosphate-N⁃Glutaryl⁃Glycine．Arginine-B．D．Allose-L⁃Arginine-B．Gentiobiose-L⁃GlutamicAcid-Dextrose+L⁃Leucine+D．Fructose-L⁃Phenylalanine+D．Galactose-L⁃Proline-D．GluconicAcid-L⁃PyroglutamicAcid-D．Melibiose-L⁃Tryptophane-D．Sorbitol-Lysine．Alanine-D．Sucrose-Acetate-GalacturonicAcid-Adonitol-L．Arabinose-Citrate-L．Rhamnose-Colistin-Mehyl．B．Glucoside-D．Mannitol-Maltulose-KetoglutaricAcid(A)-N．Acetyl．Galactosamine-Malonate-N．Acetyl．Glucosamine-PolymyxinB-Ornithine-TiglicAcid-Urea-4⁃Methylumbelliferyl-Esculin-

注：“+”为阳性，“-”为阴性

Note：＂+＂is positive； ＂-＂is negative

近年来，随着分子生物学和细菌16S rRNA基因鉴定技术的发展并用于胃微生态的研究，出现较新的关于胃内菌群以及影响胃内菌群因素的相关报道。Aviles-Jimenez等研究发现人体胃有一个复杂的微生物群定植，主要包括变形杆菌属、放线菌属、厚壁菌属、梭形杆菌属，显示了与口腔和食管内微生物群的显著区别[16]。Hu Y等使用细菌分离培养和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)也从胃内分离鉴定出201株非幽门螺杆菌[17]。Osaki等报道发现，长期幽门螺杆菌感染能改变蒙古沙鼠胃内微生物的细菌组成[18]。Nardone G等发现,长期使用PPIs和H2受体拮抗剂，能影响胃内微生态的组成，当胃内pH>3.8时可出现细菌过度增长[14]。

我们在对临床病变胃黏膜进行幽门螺杆菌分离培养的工作中发现，即使是在含有万古霉素、头孢磺啶、甲氧苄氨嘧啶和两性霉素B的幽门螺杆菌选择性培养基中仍然有非幽门螺杆菌的生长，其中不乏尿素酶阳性的非幽门螺杆菌。本次研究在354例疑为幽门螺杆菌感染者的胃黏膜组织中分离获得的非幽门螺杆菌，经16S rRNA基因测序和NCBI数据库比对，10株菌的序列比对结果与恶臭假单胞菌一致性最高。在传代保种和菌种复苏过程中，3株菌死亡，传代存活的7株菌经全自动细菌生化鉴定仪鉴定为恶臭假单胞菌。

分离培养出恶臭假单胞菌的10例病人样本均未培养出幽门螺杆菌，但有6例组织为幽门螺杆菌特异性PCR阳性，这6例PCR阳性但培养阴性的原因可能为黏膜中幽门螺杆菌数量较少，或者在运送过程中死亡，或者因患者曾经使用抗生素治疗以及恶臭假单胞菌在培养基上竞争性生长抑制了幽门螺杆菌的生长和繁殖。另4株分离得到恶臭假单胞菌的胃黏膜样本无论培养还是灵敏度较高的组织PCR均未检测到幽门螺杆菌，但这些患者的14C-尿素呼气试验却为阳性，且胃镜检查也有黏膜病变，提示胃内存在尿素酶阳性的非幽门螺杆菌。Abreu MT等报道，胃内微生态群中产尿素酶的细菌除了幽门螺杆菌，还有奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色酿脓葡萄球菌、头状葡萄球菌和微球菌属可致14C-尿素呼气试验假阳性结果[19]。部分恶臭假单胞菌也具有尿素酶活性[20]，可分解尿素产氨，氨中和部分胃酸，造成局部低酸环境，有利于细菌在胃内的生存。本实验分离得到的恶臭假单胞菌经尿素酶试纸快速检测为阳性，但临床生化鉴定却为阴性，原因为该菌种存在尿素水解试验结果不确定的菌株[20]。临床上，部分病人进行胃镜检查前曾有过抑酸剂和抗生素(如阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素)的服用史。经过治疗，胃内幽门螺杆菌的生长受到抑制，但胃生理和生态环境改变的胃黏膜可能继发一些非幽门螺杆菌的生长，特别是对治疗幽门螺杆菌感染用的抗生素耐药的细菌。本次研究从患者胃黏膜分离的7株恶臭假单胞菌均对甲硝唑、氨苄青霉素耐药，多数菌株对阿莫西林、克拉霉素耐药，然而这些抗生素正是目前常用于治疗幽门螺杆菌感染的抗菌药物。

致谢：感谢贵州医科大学消化内镜中心许良壁主任及全体工作人员的支持与帮助；感谢贵州医科大学附属白云医院内镜室的支持与帮助；感谢贵阳市儿童医院内镜室的支持与帮助；感谢黔南布依族苗族自治州人民医院的支持与帮助！

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Investigation of clinical significance ofPseudomonasputidaisolated from gastric biopsies

YIN Lin1,2, LIU Fang2, GUO Chang-cheng2, WANG Qiong2, YANG Jie3, PAN Ke4,PAN Chen3, XIONG Yan5, CHEN Ying-ting3, FANG Wen1, CHEN Zheng-hong2

(1.DepartmentofClinicalLaboratorySciences,GuizhouMedicalUniversity.Guiyang550004,China;2.DepartmentofMicrobiology,SchoolofBasicMedicalSciences,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang520025,China;3.DepartmentofGastrointestinalMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China;4.DepartmentofGastrointestinalMedicine,thePeople'sHospitalofQiannanAutonomousPrefecture,Duyun558000,China;5.DepartmentofGastrointestinalMedicine,GuiyangChildren'sHospital,Guiyang550004,China)

In order to investigate the role ofPseudomonasputidainH.pylori-associated gastrointestinal diseases, 354H.pyloripositive cases determined by14C-urea breath test were underwent endoscopy forH.pyloriisolation and identification.H.pyloriand non-H.pyloriwere identified by colonial morphology, Gram's staining, urease test andH.pylorispecific 16S rRNA gene fragment PCR amplification. Non-H.pyloriwere then inoculated on nutrient agar plate under aerobic conditions at 37℃ for 18-24 hours. Single bacterial colony was used for rapid urease test. Simultaneously, total genomic DNA were extracted from gastric mucosal tissue andH.pylorispecific 16S rDNA was amplified by PCR for rapid diagnosis. Urease positive non-H.pyloriwas selected for genomic DNA extraction and then bacterial 16S rDNA was amplified by general primers and then determined by sequencing. Sequence comparison was carried out by the BLASTn program and the GenBank databases (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Single colony which was identified asPseudomonasputidaby sequence alignment was then picked for subculturing. Drug susceptibility of 7 alive strains were detected by K-B disk diffusion method and also identified by automatic bacteria identification instrument. The results of 16S rDNA sequencing showed that a total of 10 strains were identified asPseudomonasputidafrom 354 cases. All of them are Gram's negative bacteria with urease activity. In these ten cases, 6 wereH.pylori-positive determined byH.pylorispecific PCR amplification, and 4 cases wereH.pylori-negative. All the seven alive strains ofPseudomonasputidawere susceptible to levofloxacin, 1 was susceptible to tetracycline, 5 were resistant to amoxicillin, 6 were resistant to clarithromycin and 7 were resistant to both metronidazole and Ampicillin. In conclusion,Pseudomonasputidawhich were urease-positive and resistant to antibiotic inH.pylorieradication can be isolated from diseased gastric mucosal tissue bacteria. These strains may cause false positive in clinical14C-urese breath test, and influenceH.pylori-associated gastrointestinal diseases progression.

Pseudomonasputida; culture; urease; 16S rRNA; drug resistance

Chen Zheng-hong, Email: chenzhenghong@gmc.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.011

国家自然科学基金资助项目(No．81460314)；贵阳市卫生和计划生育委员会科学技术计划项目([2014]筑卫计科技合同字第018号)联合资助

陈峥宏，Email：chenzhenghong@gmc.edu.cn

1.贵州医科大学医学检验学院临床生化教研室,贵阳 550004； 2.贵州医科大学基础医学院微生物学教研室,贵阳 550025； 3.贵州医科大学附属医院消化内科，贵阳 550004； 4.黔南布依族苗族自治州人民医院消化内科,都匀 558000； 5.贵阳市儿童医院消化内科,贵阳 550000

R378

A

1002-2694(2016)12-1102-06

2016-05-14；

2016-09-14

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81460314) and the Guiyang Municipal Health and Family Planning Commission, Science and Technology Project, 2014(No. 018)