耐盐溶磷菌PSB7的鉴定及其溶磷效果研究

范延辉，王 君*，李学平

(1.滨州学院 生命科学系/山东省黄河三角洲野生植物资源开发利用工程技术研究中心，山东 滨州 256603； 2.滨州学院 资源环境系，山东 滨州 256603)

耐盐溶磷菌PSB7的鉴定及其溶磷效果研究

范延辉1，王 君1*，李学平2

(1.滨州学院 生命科学系/山东省黄河三角洲野生植物资源开发利用工程技术研究中心，山东 滨州 256603； 2.滨州学院 资源环境系，山东 滨州 256603)

通过形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析对一株分离自黄河三角洲地区沾化冬枣根际土壤的菌株PSB7进行鉴定，并对其耐盐特性和溶磷效果进行测定，为其在提高盐碱化土壤磷素利用率方面的应用提供理论依据。结果表明，菌株PSB7为土壤杆菌(Agrobacteriumsp.)，在5～35 g/L 的NaCl液体培养基中生长良好。PSB7具有较强的溶磷能力，在改良蒙金娜无机磷液体培养基中培养7 d后，有效磷含量达72.26 mg/L，是无菌株对照的14.54倍。在含盐量0.45%的盐碱化土壤中添加PSB7，培养40 d，土壤中的有效磷含量由68.75 mg/L增加至96.60 mg/L，比未接菌对照增加了40.5%。菌株PSB7兼具耐盐和溶磷特性，在改善盐碱化土壤肥力方面具有很好的应用前景。

耐盐； 溶磷菌； 鉴定； 根际

磷是植物生长发育不可缺少的营养元素之一[1]。然而，由于土壤的固定作用，土壤中的有效磷含量极低，绝大部分有机磷和无机磷以难溶性磷酸盐形式存在，植物不能直接吸收利用，使磷成为制约作物生产的主要因素[2]。因此，开发土壤磷资源潜能，提高土壤磷素利用率，对我国农业的可持续发展具有重要意义[3]。黄河三角洲是我国最大的三角洲，地域辽阔，自然资源丰富，然而，近年来黄河断流影响了黄河三角洲地区淡水水源的补给，破坏了土壤中水盐的平衡，致使土壤盐碱化现象严重[4]，盐碱地面积已达44.3万hm2，占全区耕地总面积的52.5%。盐碱化土壤特殊的理化性质可能会导致传统的非土著溶磷菌定殖能力差、竞争力较弱、溶磷能力退化快、菌种淘汰率高等[2]。因此，筛选土著耐盐溶磷菌对于开发微生物肥料、提高盐碱土壤磷素利用率具有重要意义。大量研究结果证明，土壤中存在着大量的溶磷微生物，能够将植物难以吸收利用的磷转化为易于被吸收利用的有效磷，从而提高土壤的供磷水平[5-6]；同时，溶磷微生物还能分泌生长调节物质，促进农作物根系对锌、铜等营养元素的吸收，增强植物抗病能力[7]。然而，国内外关于溶磷微生物的研究主要侧重菌株的溶磷水平[2-3,6-16]，关于菌株的耐盐性如何却鲜有报道。为此，本研究对从黄河三角洲地区沾化冬枣根际土壤中筛选获得的一株溶磷细菌PSB7，通过形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析进行鉴定，并测定其耐盐性和溶磷能力，为提高盐碱化土壤磷素利用率提供菌种资源。

1 材料和方法

1.1 材料

供试菌株PSB7是从黄河三角洲地区沾化冬枣根际土壤中分离到的一株细菌。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL，pH 值7.0。

改良蒙金娜无机磷培养基：葡萄糖10 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、Ca3(PO4)210 g、酵母膏0.4 g、水1 000 mL，pH 值7.0～7.5。

1.2 方法

1.2.1 菌株PSB7的形态观察 在牛肉膏蛋白胨固体培养基上划线接种菌株PSB7，37 ℃恒温培养18 h，观察菌株的生长情况及菌落特征；挑取单菌落置于洁净玻片上，革兰氏染色，然后在光学显微镜下观察细胞形态及染色情况。

1.2.2 菌株PSB7的生理生化特性测定 参照《常用细菌系统鉴定手册》[17]进行。

1.2.3 菌株PSB7的16S rDNA序列测定及分子系统发育树的构建 采用细菌总DNA 提取试剂提取菌株基因组DNA。用细菌l6S rDNA通用引物(27f: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行扩增。采用25 μL PCR反应体系：2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、10 μmol/L上游引物27f 1 μL、10 μmol/L下游引物1492r 1 μL、3 UTaqplus DNA聚合酶、10× PCR buffer 2.5 μL、模板DNA 0.5 μg。反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物用l%琼脂糖凝胶电泳检测，采用Bio-Rad凝胶成像仪成像观察电泳结果。PCR产物由北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序。PCR产物测序后用BLAST进行相似性搜索和同源性比对，采用ClustalX 2.0进行序列比对分析，通过MEGA 4.1软件，采用邻接法(Neighbor-Joining method)构建系统发育树。

1.2.4 菌株PSB7的耐盐性测定 调整牛肉膏蛋白胨液体培养基中NaCl的加入量，使NaCl质量浓度分别为5、15、25、35、45 g/L，接种量为1%，pH值7.0，30 ℃振荡培养24 h，于600 nm处测定发酵液的吸光度[18]。

1.2.5 菌株PSB7的溶磷能力测定 将菌株PSB7以1%的接种量置于改良蒙金娜液体培养基中，无菌株处理为对照，30 ℃、150 r/min恒温振荡培养。每隔24 h取5 mL 培养液进行测定，其中2 mL低速(1 500 r/min)离心3 min，用等体积1 mol/L HCl稀释，去除上清液中残留的磷酸钙颗粒，于600 nm测定吸光度[19]；剩余的3 mL培养液10 000 r/min离心10 min，取上清液，用钼蓝比色法测定有效磷含量，并测定pH值[19]。

1.2.6 菌株PSB7在盐碱化土壤中的溶磷能力测定 供试土壤采自沾化县冬枣园表层(5～20 cm)土，含盐量约0.45%，为轻度盐碱化土壤。将菌株PSB7以1%的接种量置于改良蒙金娜液体培养基中，30 ℃、150 r/min恒温振荡培养5 d。取5 mL菌悬液，均匀喷洒入装有50 g土壤、容量为500 mL的锥形瓶中，以无菌水为对照。向土壤中添加适量尿素(0.36 g/kg)[20]，以补充氮源，每隔3 d喷洒无菌水，使土壤含水量保持在15%～20%(质量分数)。28 ℃恒温培养60 d，每周翻动土壤2次。利用Olsen法提取土壤中的有效磷，采用钼锑抗比色法测定有效磷含量[21]。

2 结果与分析

2.1 菌株PSB7的形态学特征

菌株PSB7为革兰氏阴性菌，杆状，无芽孢，大小为(1.5～0.3)μm ×(0.6～1.0)μm，能运动。在牛肉膏蛋白胨固体培养基上，菌落呈乳白色、不透明、圆形，表面较黏稠、凸起，易挑取(图1)。

图1 菌株PSB7的菌落形态

2.2 菌株PSB7的生理生化特性

菌株PSB7能够还原硝酸盐、水解淀粉、水解纤维素、液化明胶，不能凝固但能胨化牛奶，能够利用D-半乳糖、甘油、L-鼠李糖、麦芽糖、葡萄糖、D-木糖、乳糖、山梨糖，不能利用蔗糖、肌糖、L-阿拉伯糖。根据《常用细菌系统鉴定手册》[17]可初步判断该菌为土壤杆菌属(Agrobacterium)。

2.3 菌株PSB7的16S rDNA序列分析

经PCR扩增后菌株PSB7的16S rDNA序列全长为1 413 bp，将该序列提交GenBank 数据库(登录号为KJ957935)进行BLAST比对分析，利用MEGA 4.1软件构建系统进化树，结果如图2所示。BLAST分析结果显示,该序列与土壤杆菌属(Agrobacterium)的16S rDNA序列具有很高的同源性，其中与根癌农杆菌Agrobacteriumtumefaciens(DQ790018.1、AY850392.1、AY513490.1)、放射形土壤杆菌Agrobacteriumradiobacter(AJ130719.1)及土壤杆菌Agrobacteriumsp.DB14(JQ437544.1)的16S rDNA序列相似性均为98%。综合形态学特征及生理生化特征，确定菌株PSB7为土壤杆菌(Agrobacteriumsp.)。

图2 基于菌株PSB7 16S rDNA序列的系统发育树

2.4 菌株PSB7的生长状况及溶磷能力分析

菌株PSB7在改良蒙金娜液体培养基中培养7 d，PSB7发酵液中有效磷含量在24～96 h表现出增加的趋势，随后有效磷含量趋于平稳，7 d后有效磷含量高达72.26 mg/L，而对照组的有效磷含量仅为4.97 mg/L(图3)。菌体密度呈现出先迅速增高然后趋于平稳的趋势(图4)。发酵液的pH值总体呈下降趋势(图4)，pH值(y)与有效磷含量(x)呈负相关关系(相关性方程为y=-0.063 8x+7.695 6，R2=0.758)，但相关性不显著。

图3 菌株PSB7发酵液中有效磷含量

图4 菌株PSB7在无机磷液体培养基中的生长曲线及pH值变化情况

2.5 菌株PSB7的耐盐性分析

菌株PSB7的耐盐性试验结果如图5所示，随着NaCl质量浓度的增加，菌株PSB7的生长量先增加后降低，在NaCl质量浓度为5～35 g/L 的牛肉膏蛋白胨培养基中生长良好，在NaCl质量浓度为45 g/L的牛肉膏蛋白胨培养基中也能缓慢生长。综上，菌株PSB7具有较强的耐盐性。

图5 菌株PSB7在不同NaCl质量浓度下的生长情况

2.6 菌株PSB7在盐碱化土壤中的溶磷能力分析

为了确定菌株PSB7在盐碱化环境中的应用潜力，对PSB7进行了盐碱化土壤溶磷效果研究。接种菌株PSB7后供试土壤有效磷含量如图6所示。由图6可以看出，在60 d的测定期内，接菌土壤中的有效磷含量均较未接菌对照明显提高，且随着培养时间的延长，其呈先增加后降低的趋势， 40 d时有效磷含量最高，达96.60 mg/L，比未接菌对照增加了40.5%。

图6 菌株PSB7在盐碱化土壤中的溶磷情况

3 结论与讨论

自1903年Stalstrom[22]从土壤中发现溶磷微生物以来，世界各国相继展开了相关研究。迄今为止，已报道的溶磷微生物有36个属89种，包括细菌、真菌和放线菌等类群[3,23]。其中，关于溶磷细菌的报道最多，主要有土壤杆菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、肠细菌属(Enterobacter)、微球菌属(Micrococcus)、固氮菌属(Azotobacter)和多硫杆菌属(Thiobacillus)等[24]。目前，关于溶磷微生物的研究主要集中在溶磷能力方面[25-26]，许多溶磷细菌具有很强的溶磷能力。白文娟等[27]对玉米根际溶磷细菌进行分离，筛选出38 株溶解无机磷菌株，其中代表性溶磷细菌SWJ1-4的溶磷量为108.31 mg/L；戴沈艳等[28]从江西鹰潭红壤中分离获得一株性状稳定的高效溶磷细菌T4，该菌溶解AlPO4、磷矿粉的能力均比较高，分别为334.2 、193.1 mg/L。但这些溶磷菌并不一定能适应盐渍化环境，并在盐碱化土壤中定植进而发挥其溶磷作用。研究表明，溶磷菌的分布呈强烈的根际效应，即根际土壤中溶磷微生物的数量较非根际土壤中多[2]。近年来，从植物根际土壤中筛选高效溶磷菌成为提高土壤磷有效性研究的热点[29-30]。本研究筛选到的土壤杆菌PSB7的溶磷能力为72.26 mg/L，虽然与其他已报道农作物根际溶无机磷细菌的溶磷能力相比不是很高，但PSB7较强的耐盐性为其在盐碱化土壤中的应用提供了保障。菌株PSB7在盐碱化土壤中的溶磷效果表明，该菌在提高盐碱化土壤磷素利用率方面有很大潜力。

微生物的溶磷机制因菌株的不同而有所不同，主要有有机酸的分泌、质子的释放、H2S作用、CO2作用和产生磷酸酶[2]。研究表明，产低分子量有机酸是微生物溶磷的主要机制[31-32]，在酸性条件下难溶性磷酸盐能够溶解；另外，有机酸可与磷矿粉中铁、铝、镁、钙等金属离子发生沉淀、络合、螯合反应，从而使磷酸根释放出来。因此，微生物的溶磷能力往往与培养液的pH值存在一定的负相关性[29-30]。试验中发现，菌株PSB7在液体蒙金娜培养基中进行培养时，发酵液的pH值在培养7 d内一直呈现下降的趋势，虽然溶磷量与培养基pH值呈负相关，但相关性不显著，其具体溶磷机制还有待进一步研究。

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Identification of Phosphate-solubilizing Halotolerant Strain PSB7 and Its Phosphate-solubilizing Effect

FAN Yanhui1,WANG Jun1*,LI Xueping2

(1.Department of Life Sciences,Binzhou University/Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of Yellow River Delta,Binzhou 256603,China; 2.Department of Resource and Environment,Binzhou University,Binzhou 256603,China)

A phosphate-solubilizing strain PSB7 isolated from the rhizosphere of winter jujube was identified based on its morphology,physio-biochemical characters and 16S rDNA sequence analysis,and its salt resistance ability and phosphate-solubilizing effect were also studied to provide a theoretical basis for improving saline soil phosphorus utilization rate.Strain PSB7 was identified asAgrobacteriumsp.The salt resistance test demonstrated that strain PSB7 grew well under NaCl concentration of 5—35 g/L.PSB7 could produce 72.26 mg/L available phosphate after 7 days in the liquid tricalcium phosphate medium,which was 14.54 times more than the control,and increase the available phosphate content by 40.5%,from 68.75 mg/L to 96.60 mg/L,after 40 days in the soil with 0.45% salinity.Strain PSB7 had both phosphate-solubilizing and salt-resistance properties,which had great potential to improve phosphorus utilization rate in saline soil.

halotolerancy； phosphate-solubilizing microorganism； identification； rhizosphere

2016-01-23

山东省高等学校科技计划项目(J10LC55)；滨州学院科研基金项目(2009ZDL03，BZXYFB20110512)；山东省重点研发计划项目(2015GNC111018)

范延辉(1980-)，男，山东即墨人，讲师，硕士，主要从事土壤微生物研究。E-mail：yanhuifan@163.com

*通讯作者：王 君(1982-)，女，山东滨州人，副教授，博士，主要从事环境微生物研究。E-mail：ivywangjun@163.com

S154.39

A

1004-3268(2016)07-0056-05