复合酶法制备海参内脏ACE抑制肽工艺研究

蔡彬新，周逢芳，林则圣

（宁德师范学院生物系，福建 宁德 352100）

复合酶法制备海参内脏ACE抑制肽工艺研究

蔡彬新，周逢芳，林则圣

（宁德师范学院生物系，福建 宁德 352100）

采取复合酶法探讨海参内脏中ACE抑制肽的制备工艺，研究温度、时间、pH值、料液比、酶量5个因素对ACE抑制率和水解度的影响。通过单因素和正交试验，得到海参内脏ACE抑制肽制备最佳工艺组合为A2B2C3D2，即反应时间为5 h、温度50℃、酶量2%、pH值为7.5，此条件下海参内脏多肽ACE抑制率可达到55.4% 。

海参；ACE抑制肽；水解度；正交试验

海参（sea cucumber，Ludwigothurea grisea）为海参纲无脊椎棘皮动物［1］，具有良好的药用价值。近几年，在海参中发现许多重要的生理活性物质，如多肽、皂苷、胶原蛋白等［2-3］，研究发现，海参多肽具有很好的降血压效果［4-5］。内脏作为海参的一部分，在鲜海参加工过程中常被丢弃，如果能从中提取活性物质再利用，不仅可避免因环境污染，而且能提高海洋生物开发利用的附加值。

为使海参内脏加工副产物实现资源化高附加值利用，本研究选用海参内脏作为原料，采用复合蛋白酶水解方法制备海参内脏ACE抑制肽，通过单因素试验和正交试验相结合的方法，对复合蛋白酶水解条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试海参购于宁德霞浦海参养殖场；中性蛋白酶（酶活力6万U/g）、风味蛋白酶（20万U/g）购于北京索莱宝科技有限公司；血管紧张素转化酶（ACE）、马尿酰组氨酰亮氨酸（HHL）购于Sigma公司；其他化学试剂均为AR试剂，购于国药集团有限公司。

仪器：MC电子天平（奥豪斯公司），UV2550紫外光分光光度计（日本岛津），PB-10PH计（上海般特公司），高速冷冻离心机（sigma公司），1200高效液相色谱仪（安捷伦公司）。

1.2 试验方法

1.2.1海参内脏ACE抑制肽制备工艺 将海参内脏洗净，组织绞碎，取一定量搅碎物，加入2倍体积蒸馏水及适量的复合蛋白酶（中性蛋白酶和风味蛋白酶，1∶1），调节pH值，在一定温度下，保温水解一定时间。水解完沸水浴灭酶10 min 后，于4℃、12 000 r/min 离心15 min，取上清液，获得海参酶解液，测定其水解度和ACE抑制率。

1.2.2单因素试验 （1）pH值：固定料液比1∶2、水解温度50℃、水解时间5 h、加酶量2%，探讨初始pH值6、6.5、7、7.5、8等5个不同水平对海参内脏ACE抑制率和水解度的影响。

（2）温度：固定料液比1∶2、pH值7、水解时间5 h、加酶量2%，探讨反应温度为45、50、55、60、65℃等5个不同水平对海参内脏ACE抑制率和水解度的影响。

（3）酶量：固定料液比1∶2、水解温度50℃、pH值7、水解时间5 h，探讨加酶量1%、1.5%、2%、2.5%、3%等5个不同水平对海参内脏ACE抑制率和水解度的影响。

（4）料液比：水解温度50℃、pH值7、水解时间5h、加酶量2%，探讨料液比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5等5个不同水平对海参内脏ACE抑制率和水解度的影响。

（5）反应时间：固定料液比1∶2、水解温度50℃、pH值7、加酶量2%，探讨反应时间3、4、5、6、7 h 等5个不同水平对海参内脏ACE抑制率和水解度的影响。

1.2.3正交试验 根据单因素试验结果，设计L9（34）正交试验，以水解时间（A）、温度（B）、酶浓度（C）、pH（D）4个因素进行试验，各因素水平见表1。

表1 L9（34）正交试验因素水平

1.3 测定项目及方法

原料中的总氮含量：采用凯氏定氮法（GB／T 5009.5.2010） 测定。

氨基氮量测定：分别用茚三酮法［6］和甲醛滴定法［7］测定水解度，比较分析两种方法的测定结果，选择一种合适的方法进行海参内脏水解液氨基氮量的测定。

式中，A为原料中总氮量，B为水解液中的α-氨基氮量。

水解液ACE抑制率测定：根据Cushman方法［8］改进，取2.0 mg/mL刺参酶解液40 μL，加入25 mU/mL ACE溶液20 μL，于37℃下保温5 min后加入HHL溶液50 μL开始反应，反应60 min后加入1.0 mol/L HCl 200 μL中止反应，得到反应液，利用HPLC进行分析测定；同时用pH 8.3的硼酸缓冲液40 μL替代刺参酶解液制备反应液，作空白对照。色谱检测条件：色谱柱Zorbax SB-C18分析柱（4.6×250 mm，填料粒径5 μm）；柱温：25℃；流动相∶乙睛-水（25∶75，V/V，各含0.1%三氟乙酸）；流速：1 mL/min；检测波长：228 nm；进样量：10 μL。

式中，M为空白对照中马尿酸的峰面积，N为样品中马尿酸的峰面积。

2 结果与分析

2.1 水解度测定方法

茚三酮法和甲醛滴定法测定海参内脏蛋白水解度分别为25.1%和24.2%，说明采用茚三酮法和甲醛滴定法测定海参蛋白水解度差别不大，故两种方法都可用于测定其水解度。由于茚三酮法所用的显色剂稳定性较差，导致比色时读数不稳定，且采用单一的甘氨酸作标准，不同的氨基酸对茚三酮的显色程度都有一定的偏差，因此本试验选择甲醛滴定法测定水解度。

2.2 海参内脏ACE抑制肽制备单因素试验结果

2.2.1反应温度对水解度和ACE抑制率的影响 由图1可知，随反应温度的升高，海参内脏蛋白水解度呈先上升后下降的趋势，温度为50℃时水解度最高，为26.5%，55～60℃水解度下降较快；同时，ACE抑制率也呈先上升后下降的趋势，温度为50℃时，ACE抑制率最高、为48.6%。这可能是由于温度较低时，升温能加快反应速度，而温度过高则会破坏酶结构，反而降低酶解效率。因此选择50℃作为水解海参内脏多肽的最佳温度。

图1 反应温度对水解度和ACE抑制率的影响

2.2.2反应时间对水解度和ACE抑制率的影响 由图2可知，随反应时间的延长海参水解度先上升后平缓，而ACE抑制率4～6 h范围内呈上升趋势，6～8 h开始下降。水解度的变化趋势可能是由于在6 h前，酶量较多，海参蛋白酶解快，但反应6 h后酶已经用完，也可能是海参蛋白已酶解到一定程度使酶与其结合的机率降低，从而导致酶解速度降低；ACE抑制率早期上升趋势主要是因为随着水解度增加，多肽量增多导致抑制率增大，而5 h后抑制率降低，可能是过度水解生成了ACE抑制活性较低的小分子多肽。综合考虑反应温度对水解度和ACE抑制率的影响，选择5 h作为水解海参多肽的最佳酶解时间。

图2 反应时间对水解度和ACE抑制率的影响

2.2.3初始pH值对水解度和ACE抑制率的影响 由图3可知，当初始pH值较低时，水解度和ACE抑制率都先升高后降低，但总体变化幅度较小。原因可能是虽然每种酶都有最适pH值，由中性蛋白酶和风味蛋白酶组成的复合酶其最适pH值范围较广，在6.5～7.5间都适合，对水解效果影响小。

图3 pH值对水解度和ACE抑制率的影响

2.2.4酶量对水解度和ACE抑制率的影响 由图4可知，随着酶量的增加水解度也增加，当加酶量达2.5%左右时，趋于平衡。ACE抑制率在不同的酶与底物浓度下差异显著，在酶量1%～1.5%的范围内，ACE抑制率显著增大；随后减小，酶量2%～2.5%间ACE抑制率显著减小，而后趋于平缓。原因可能是初期底物多、酶量少时，酶反应次数多，多数大分子蛋白在较短时间内被降解成小分子肽，而当酶量过高时，受底物数量的限制，水解度不再增加。对于抑制率的现象可能是初期随着酶解产生有活性的多肽，但随着酶用量的增大，造成过度水解生成了ACE抑制活性较低的小分子多肽。综合考虑反应温度对水解度和ACE抑制率的影响，选择2%酶量作为水解海参多肽的最佳酶量。

图4 酶量对水解度和ACE抑制率的影响

2.2.5料液比对水解度和ACE抑制率的影响 由图5可知，随着料水比的增加，水解度和ACE抑制率呈递增趋势，到料液比1∶2时开始下降。原因可能是反应中水增加，降低了底物与酶的浓度，造成底物与酶结合机会的降低，从而降低酶解效率。ACE抑制率随着水解度的降低，多肽量减少使抑制率降低，因此选择1∶2作为试验水解海参内脏多肽的最佳料液比。

图5 料液比对水解度和ACE抑制率的影响

2.3 海参内脏ACE抑制肽制备工艺的优化

海参内脏ACE抑制肽单因素分析结果表明，水解度和ACE抑制率变化并不一一对应，但由于制备ACE抑制率效果好的海参内脏多肽是本试验的主要目的，因此选择ACE抑制率作为指标，进行4因素（A 时间、B 温度、C pH值、D酶浓度）3水平L9（34）正交试验，结果见表2。从表2可以看出，影响ACE抑制率强度的各因素依次为水解时间＞温度＞酶浓度＞pH，最优组合为A2B2C3D2，即反应时间为5 h、温度50℃、pH值为7.5、酶量2%。

表2 海参内脏ACE抑制肽制备正交试验结果

为弥补极差分析方法缺陷，进一步对正交试验进行方差分析，判断各因素对ACE抑制率的影响作用是否显著，结果见表3。由表3可知，水解温度、水解时间、酶浓度等因素对ACE抑制率影响作用显著，pH值影响不显著。

表3 正交试验方差分析结果

3 结论

多肽的制备方法有酶法、碱法等，酶解法条件温和，肽的活性破坏小，水解过程中的环境污染小。酶法制备ACE抑制肽常用的酶有多种，不同酶对蛋白的切割位点不同，产生的多肽不同，即使同一种酶在不同条件下其酶解的能力也有很大区别。本试验选用复合酶酶解海参内脏蛋白产生ACE活性肽，并对海参内脏蛋白的水解条件进行优化，结果表明，影响ACE抑制率强度的各因素依次为水解时间＞温度＞酶浓度＞pH，即水解温度、水解时间和酶浓度对ACE抑制率影响作用显著，pH值对其影响不显著，最优组合为A2B2C3D2，即反应时间为5 h、温度50℃、酶量2%、pH值为7.5，在此条件下ACE抑制率55.4%。

［1］ 廖玉麟.中国动物志·棘皮动物门海参纲［M］.北京：科学出版社，1997.

［2］ 马天舒，葛迎春.海参活性物质的药理研究进展［J］.特产研究，2003（1）：57-60.

［3］ 赵芹.海参胶原蛋白多肽抗氧化的研究［D］.青岛：中国海洋大学，2008.

［4］ 赵元晖，李八方，曾名湧，等.一种低值海参蛋白酶解物降血压活性的研究［J］.渔业现代化，2009，36（1）：56-59.

［5］ 朱小杰，曾名湧，马桂兰，等.海地瓜蛋白酶解物类蛋白反应修饰及其对ACE活性的影响［J］.中国海洋药物杂志，2011，30（6）：6-12.

［6］ 李理.蛋白质水解产物中多肽得率的测定方法研究［J］.现代食品科技，2010，26（8）：84-86.

［7］ 杨文博，张英华.蛋白质水解度的测定方法研究［J］.中国调味品，2014，39（3）：88-91.

［8］ Fitz Gerald R J，Meisel H.Milk protein-derived peptide inhibitors of Angiotmsin- converting enzyme［J］.BrJNutr，2000，84：33-37.

（责任编辑 邹移光）

Preparation of ACE inhibitory peptides from sea cucumber viscera by complex enzyme

CAI Bin-xin，ZHOU Feng-fang，LIN Ze-sheng
（Department of Biology，Ningde Normal University，Ningde 352100，China）

The method of complex enzyme was used to prepare ACE inhibitory peptides from sea cucumber viscera， and five factors affecting peptides preparation，such as temperature，time，the ratio of solid toliquid， pH and amount of enzyme were studied.The optimal parameters for the preparation of ACE inhibitory peptides were determined through single factor experiment and orthogonal test as follows：temperature at 50℃ ，time for 5 h，pH 7.5 and amount enzyme of 2%.Under these conditions，ACE inhibitory rate was up to 55.4%.

sea cucumber；ACE inhibitory peptides；degree of hydrolysis（DH）；orthogonal test

TS254.9

A

1004-874X（2016）12-0085-05

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.12.015

2016-08-10

福建省科技重点项目（2014N0016）；宁德市科技局项目（20130139）；宁德师范学院服务海西项目（2012H315）

蔡彬新（1983-），女，硕士，讲师，E-mail：binxin3@sina.com;zhoufengfang123@163.com

蔡彬新，周逢芳，林则圣.复合酶法制备海参内脏ACE抑制肽工艺研究［J］.广东农业科学，2016，43（12）：85-89.