HPLC法测定肝龙胶囊中肌苷的含量

李宇驰，徐 妍，杨永寿，肖培云*

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000；2.云南省昆虫医药研发重点实验室，云南大理 671000）

HPLC法测定肝龙胶囊中肌苷的含量

李宇驰1，徐 妍1，杨永寿2，肖培云1*

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000；2.云南省昆虫医药研发重点实验室，云南大理 671000）

目的：建立肝龙胶囊中肌苷的含量测定方法，为肝龙胶囊的质量控制提供依据。方法：采用Gemini 5u C18110A（250 mm× 4.6 mm）色谱柱，流动相水（含0.05%TFA）：乙腈（含0.05%TFA），采用梯度洗脱方式，流速0.8 mL∕min，柱温30℃，DAD检测器，检测波长为214 nm，进样量10 μL。结果：肌苷在0.202～2.020 μg范围之间峰面积值与进样量（μg）线性关系良好，平均回收率（n=9）为96.9%，RSD为2.18%。结论：建立的肝龙胶囊中肌苷含量测定方法科学、简便、结果准确，可作为提高肝龙胶囊质量标准的检测项目。

肝龙胶囊；肌苷；含量测定

肝龙胶囊是由药用昆虫美洲大蠊（Periplaneta americana）的干燥虫体经提取得到的活性部位研制而成，是治疗病毒性乙型肝炎和肝纤维化作用的中药二类新药，标准编号为YBZ04142005-2011Z，具有疏肝理脾，活血解毒的功效，并具有抗肝损伤作用〔1〕。该药具有疗效好，价格低，给药方便等优点。研究表明，肝龙胶囊不仅对防治乙肝病毒有较好的疗效，还具有抗病毒、抗氧化、防治慢性酒精性肝损伤，提高机体免疫功能等作用〔2-8〕。由于肝龙胶囊的质量控制方面的研究较少，目前质量标准中的含量测定项以总氨基酸为测定指标，缺乏专属性。研究表明，肌苷是肝龙胶囊活性部位中的已知成分〔9〕，为进一步提高肝龙胶囊质量标准的可控性，本文采用高效液相法对肝龙胶囊中肌苷的含量测定方法进行研究。

1 仪器与材料

1.1仪器1100型高效液相色谱仪（包括G1311A四元泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315B DAD检测器，美国安捷伦公司）；超声波清洗器（SK3200LH型，上海科导超声仪器有限公司）；分析天平（AL240-IC型，梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.2材料肝龙胶囊（昆明赛诺制药公司，批号：15122002、15101201、15091701、15082002、15062401、 15042202）；肌苷（中国食品药品检定研究院，批号：140669-201305，Mr=268）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1色谱条件以及肌苷峰的确定采用Gemini 5u C18110A（250 mm×4.6 mm）色谱柱，流动相水（含0.05%三氟乙酸，以下简称含0.05%TFA）：乙腈（含0.05%TFA），采用梯度洗脱方式，流速0.8 mL∕min，柱温30℃，DAD检测器，检测波长为214 nm，进样量10 μL，按表1中的梯度洗脱程序进行洗脱，色谱图见图1，可知供试品的S峰与肌苷保留时间一致，并利用DAD检测器对其图谱进行二维检测，光谱图见图2，结果显示，供试品的S峰与肌苷峰的紫外吸收图谱相同，进一步确定S峰即为肌苷峰。

表1 梯度洗脱条件

图1 肌苷色谱图

图2 对照品与供试品中肌苷峰扫描图

2.2溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取肌苷对照品适量，加蒸馏水制成每1 mL含0.202 mg的溶液，混匀，即得。

2.2.2 供试品溶液制备 取同一批次的胶囊20粒，倾出内容物，计算平均粒重，充分研细，混匀。精密称取研细后的内容物约70 mg于10 mL量瓶中，加适量蒸馏水超声15 min溶解，定容至刻度，混匀，过滤。取续滤液适量，用0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。

2.3线性关系精密吸取对照品溶液1、2、4、6、8、10 μL注入色谱仪，按“2.1”色谱条件测定。以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。得线性方程为Y=2 050.7X-298.63，r=0.999 5，结果表明肌苷在0.202～2.020 μg范围内峰面积值与进样量（μg）呈良好的线性关系。

2.4精密度实验取“15062401”批次的肝龙胶囊按“2.2.2”项制备供试品溶液，精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，连续进样6次，以肌苷峰面积进行计算，RSD为0.24%，结果表明仪器的精密度良好。

2.5重复性实验取“15062401”批次的肝龙胶囊，按“2.2.2”项制备6份供试液，精密吸取各供试液10 μL注入高效液相色谱仪进行测定，以肌苷峰面积计算，RSD为0.56%，经计算得样品含量为14.07 mg∕g，结果表明方法重复性良好。

2.6稳定性实验取“15062401”批次的肝龙胶囊制备的供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样10 μL，肌苷峰面积的RSD值为0.89%，表明供试品溶液中肌苷在室温下放置12 h稳定。

2.7加样回收率实验精密称取“15062401”批次样品适量于5 mL量瓶中，平行称取9份，根据样品中所含肌苷的平均含量（14.07 mg∕g），按含量的高、中、低加入对照品，依“2.2.2”项制备供试液，按“2.1”项色谱条件进样测定。见表2。

表2 加样回收率试验（n=9）

2.8样品含量测定取不同批次的样品，按“2.2.1”项制备供试液，按“2.1”项色谱条件进样测定。见表3。

表3 样品含量测定结果（n=3）

3 讨论

实验考察了phenomenex Gemini 5u C18110A（4.60mm×250mm）、AglientZORBAXSB-C18（4.60mm× 250 mm，5 μm）及Waters Symmetry ShieldTMRP18（4.60 mm×250 mm，5 μm）的C18色谱柱，结果表明，采用phenomenex Gemini 5u C18110A（4.60 mm×250 mm）色谱柱时，色谱峰分离效果最好，且基线平稳。在流动相选择时，分别考察了乙腈（0.05%TFA）-水（0.05%TFA）、乙腈-水（0.05%TFA）、乙腈-水3种洗脱体系对样品分离的影响，结果表明，采用乙腈（0.05%TFA）-水（0.05%TFA）为流动相时，色谱峰分离度和对称性良好。实验采用DAD检测器对检测波长进行筛选，发现在214 nm波长下色谱图的基线平稳，且相邻色谱峰无干扰，故选择214 nm作为检测波长。同时，在确定上述条件的基础上，分别对流速（0.7、0.8、0.9 mL∕min）和温度（25、30、35℃）进行了考察。结果表明，样品在柱温为30℃、流速在0.8 mL∕min时分离效果最好，且基线漂移较小。

本研究建立了肝龙胶囊中肌苷含量的测定方法，并测定了6批肝龙胶囊中肌苷含量，该方法回收率高、精密性良好、方便快捷。可为完善肝龙胶囊质量标准检查提供参考。

〔1〕夏盟恺，曾菁，牛春丽，等.肝龙胶囊和美洲大蠊脱脂膏对正常大鼠胆汁分泌的影响〔J〕.大理学院学报，2015，14（2）：4-7.

〔2〕杜一民，李树楠，陈鸿珊，等.新药肝龙胶囊对雏鸭体内鸭乙型肝炎病毒的抑制效果〔J〕.大理学院学报，2006，5（4）：6-8.

〔3〕张旭强，吴红兵，彭丽，等.肝龙胶囊对大鼠慢性酒精性肝损伤的防治作用研究〔J〕.中国中药杂志，2013，38（13）：2197-2201.

〔4〕杜一民，陈鸿珊，李树楠，等.治疗乙型肝炎新药肝龙胶囊的药效学初步研究〔J〕.时珍国医国药，2006，17（8）：1369-1371.

〔5〕杨永荣，缪新权，梅光涛，等.肝龙胶囊治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎的疗效观察〔J〕.云南医药，2008，29（2）：182-183.

〔6〕张成桂，焦春香，何正春，等.肝龙不同有效部位体外抗氧化活性的分析〔J〕.时珍国医国药，2011，22（1）：69-71.

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〔8〕肖笛，陈盛阳，马坤，等.肝龙胶囊对离体在体肠肌收缩活动的影响〔J〕.云南中医中药杂志，2013，34（1）：64-66.

〔9〕那凯歌，满红霞，谭巧云，等.肝龙胶囊中总肽含量及其分子量分布的研究〔J〕.中国生化药物杂志，2015，36（3）：159-161.

HPLC Method for Determination of the Inosine Content in Ganlong Capsule

Li Yuchi1,Xu Yan1,Yang Yongshou2,Xiao Peiyun1*
（1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.Key Laboratory of Pharmaceutical R&D of Insects in Yunnan Province,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To establish a determination method of the content of inosine in Ganlong capsule for providing the basis for Ganlong capsule quality control.Methods:Gemini 5u C18110A（250 mm×4.6 mm）chromatographic column,mobile phase water（0.05%TFA）:acetonitrile（0.05%TFA）,gradient elution,0.8 mL∕min flow,30℃column temperature,DAD detector,214 nm detection wavelength,10 μL sample quantity were used in the study.Results:Peak area of inosine between 0.202-2.020 μg range and injection volume（μg）showed a linear relationship.The average recoveries（n=9）was 96.9%,RSD=2.18%.Conclusion:The established method of determination Ganlong capsules is scientific,simple and accurate,which can be used to improve Ganlong capsule quality standard test project.

Ganlong capsule;inosine;determination

R917

A

2096-2266（2016）12-0040-03

10.3969∕j.issn.2096-2266.2016.12.009

（责任编辑 李 杨）

国家自然科学基金资助项目（81360634；81560634）；云南省科技厅应用基础研究基金资助项目（2015FA025）

2016-08-26

2016-09-08

李宇驰，硕士研究生，主要从事美洲大蠊活性提取物研究. *通信作者：肖培云，教授.