环介导等温扩增技术在病原微生物检测中的应用进展

林茂锐，杨华文 综述 曹东林 审校

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环介导等温扩增技术在病原微生物检测中的应用进展

林茂锐，杨华文 综述 曹东林 审校

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification， LAMP）是一项新的核酸快速扩增技术，具有特异性高、速度快、操作简单等特点，非常适用于现场检测和基层检测，在突发公共卫生事件中将起重要的作用。笔者简要概述了LAMP技术在病原微生物检测中的应用。

环介导等温扩增；病原微生物

近年来，新发传染病如寨卡病毒病、中东呼吸综合征、传染性非典型肺炎、登革热等频频暴发，这些新发疾病既对我国传染病的防控提出了更高要求，也警示我国传染病的防控、诊治依然是公共卫生问题的重要挑战之一。建立和发展重大传染病病原体快速、早期的实验室诊断技术平台并标准化，能及早明确传染病病原体的类别及流行病学数据，为传染病的预警、及时高效的防控及采取恰当的应急方案提供理论依据。环介导等温扩增 （loop-mediated isothermal amplification， LAMP）技术是由日本科学家Notomi等［1］新开发的一种核酸等温扩增方法。世界各国的微生物科研工作者运用LAMP技术及其衍生技术在临床细菌、病毒、寄生虫的快速检测，食物中毒致病菌，动植物检疫、环境及畜牧业等病原体的检测方面已取得重大进展，随着其技术体系的完善并与其他核酸扩增技术的交叉互补，可以预见该技术在传染性疾病的初筛中将发挥极大作用。笔者简要概述了LAMP技术在病原微生物检测中的应用。

1 LAMP简介

1.1 技术原理 利用Bst脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid， DNA）聚合酶和根据靶序列设计两对（四条）特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件（60～65 ℃）启动循环链置换反应保温30～60 min，可扩增出超过109拷贝的靶序列，同时产生肉眼可见的白色沉淀（焦磷酸镁）。反应进行时，内引物与目标DNA杂交后，启动互补链合成，产生哑铃状DNA。随后以自身为模板，进行DNA合成延伸，形成茎-环DNA结构，此为LAMP循环的起始结构。由于内引物杂交在茎-环的环上，引物链置换合成DNA产生一个有缺口的茎-环DNA中间媒介，在茎上附有目标序列。然后，再通过外引物，在茎的末端形成环状结构，结果在同一链上互补序列周而复始，从而形成有多环的、花椰菜结构的茎-环DNA混合物，达到靶序列扩增的目的［1］。

1.2 技术优势 LAMP 技术是类似于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR）的一种核酸快速高效扩增方法，其优势主要有：（1）扩增温度恒定，无需变性DNA 双链；（2）高特异性，针对靶基因片段的6个区域，设计4条引物，事先需明确这6个区域的顺序；（3）灵敏度高，扩增DNA模板只需10个拷贝或更少，检测线性范围达5个数量级；（4）快速、高效扩增，目的DNA扩增时间为30～40 min，若在引物上再进一步改进，可大大提高其扩增效率，甚至可在20 min内完成，而且扩增DNA产率很高，肉眼即可观察到白色沉淀；（5）操作简便，一种方法为肉眼或添加荧光染料观察，另一种方法利用浊度仪检测扩增产物浊度；（6）成本低廉，无需特殊的培训和设备，只需一个水浴锅即可，适合大规模筛检和基层卫生医疗机构检验［2］。

2 LAMP在病原微生物快速检测中的运用

2.1 病毒检测 Nyan等［3］利用LAMP方法检测临床血清样本中乙肝病毒的基因亚型A-F，模板DNA采用标准试剂盒提取或直接将血清加热后用于扩增，并与乙肝病毒标准血清盘比较，LAMP法最低检测限可达10 U，特异性100%，适用于临床标本检测。Poon等［4］设计特异性引物、建立环介导反转录等温扩增技术（reversetranscription loop-mediated isothermal amplification， RTLAMP），临床样本检出率为64%，其较实时定量PCR灵敏度稍低，但高于常规PCR方法，成本较低，显示具有在发展中国家或床边检测潜力。Rudolph等［5］首次证明采用RT-LAMP方法可快速检出急性人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus， HIV）感染，具体方法是针对HIV-1 HXB2基因片段设计引物，采用RT-LAMP技术对HIV感染细胞株和病例血清进行检测，并与抗体快速检测及通过美国食品药品管理局认证的其他免疫学方法比较，在更早的感染阶段（早于2周）即可检测出，还建议向即时检验方向发展，对于急性HIV感染的检出和感染随时监控具有重要意义。而Ocwieja等［6］运用生物信息学的方法针对HIV多种亚型（A、B、C、D、G）设计了一系列引物并筛选出最佳引物后，建立了RT-LAMP的方法，为后续建立即时检验方法打下了良好基础。一种新的禽流感病毒于2013年在中国暴发后，Bao等［7］通过RT-LAMP技术建立了快速诊断方法，能有效从不同样本来源（鸡、鸽子、人及环境）扩增出目的基因，其最低检测限可达到0.01 pfu，是RT-PCR法的10倍，也具有良好特异性，约30 min即可完成实验，并在临床标本中得到很好验证。之后，Luo等［8］采用类似的RT-LAMP法建立快速检测禽流感病毒，均显示良好的有效性和快速性。Kaneko等［9］利用LAMP技术检测单纯疱疹病毒HSV-1、HSV-2及水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus，VZV），其敏感性10倍于PCR方法。此外，LAMP技术在检测登革病毒［10］、EV71手足口病毒［11］、中东呼吸综合征冠状病毒［12］、星状病毒［13］等方面均有报道，无论是DNA还是核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）病毒，LAMP均能快速检测，尤其是在检测RNA病毒时，省去了RT-PCR法中费时的反转录步骤，减少了交叉污染的机会，更加快捷方便。

2.2 细菌检测 Maruyama等［14］最先应用LAMP技术检测大肠杆菌O157：H7细胞中的stxA2基因，建立了原位LAMP（In Situ LAMP），与原位PCR比较，其扩增温度更低，细胞损伤更小，扩增后的图像也更清晰。曹东林等［15］建立了实时荧光环介导等温扩增快速检测结核分枝杆菌的方法，此扩增法对结核和非结核分枝杆菌标准菌株检测的敏感性和特异性均为100%，最低检测限可达102个菌/ml；检测的敏感性为94.64%，特异性为96.55%，与定量PCR相比，其特异性相似，但敏感性更高。Li等［16］以具有呼吸病临床症状患者的痰液为研究对象，证明了Rv2461c基因是LAMP方法检测结核分枝杆菌的一个非常有效而明确的核酸扩增测试靶标，具有很高的敏感性和特异度。另外，Ou等［17］及Joon等［18］分别就肺结核和肺外结核患者标本建立LAMP检测方法，以期能快速、早期诊断结核杆菌的感染。朱水荣等［19］针对嗜肺军团菌mip基因设计5条引物，对血清型嗜肺军团菌和非嗜肺军团菌及其他细菌进行检测，结果证明LAMP方法的检出率高于传统培养分离方法及定量PCR，适合基层检验部门及小型实验室与现场监测等使用。Felsenstein等［20］针对儿童常见链球菌感染致咽炎，建立LAMP检测方法，与特异抗原检测及常规培养比较，具有更高的敏感性和特异性。此外，目前LAMP还成功用于志贺菌、碳青霉烯类抗生素耐药鲍氏不动杆菌、大肠杆菌等细菌类病原微生物［21-23］，以上细菌研究结果均表明，与定量PCR比较，LAMP技术扩增速度更快、敏感性和特异性也很高。

2.3 寄生虫检测 Cook等［24］在对无临床症状的疟原虫感染者，通过LAMP法进行大规模的筛选，并与胶体金快检法、定量PCR法比较，证明了LAMP法和PCR法均具有较高的阳性检出率，但是LAMP法更快捷，仪器要求更低。杨秋林等［25］利用LAMP法扩增日本血吸虫尾蚴DNA，以华支睾吸虫为阴性对照，建立方便快捷的检测方法。Matovu等［26］分别采用LAMP和PCR方法对患者血液标本中的锥虫进行检测，结果表明PCR法用时约长于LAMP法5倍。另外，Fallahi等［27］对刚地弓形虫RE和B1基因分别进行LAMP扩增和巢式PCR，结果两种方法特异性都很高，近乎100%，但前者的敏感性更高。Ocker等［28］对150例连续性疟疾患者标本分别采用LAMP法、显微镜观察法、巢式PCR法检测，结果显示LAMP法的敏感性和特异性与巢式PCR法高度一致。此外，LAMP还可用于真菌的检测，如白色念珠菌及支原体的检测［29，30］。

3 拓 展

3.1 扩增模板的拓展 针对细菌检测，LAMP主要检测其相应特异、保守的基因（DNA片段），而一些RNA病毒则需在反应体系中增加反转录环节，但一般为避免交叉污染，反转录与LAMP反应在同一体系中进行并最终形成RT-LAMP法［31］。对于病原体标本，LAMP法对模板要求不高，无需对样本的核酸提取纯化。部分厂家为了应对快速检测的要求，甚至对一些标本采用一次性注射器加入核酸提取试剂，不进行复杂提取过程即可行LAMP扩增，在应用中更快速、简便，减少交叉污染的机会。

3.2 扩增产物检测方法的变化 对于LAMP扩增产物的检测目前主要有4种方法：（1）经琼脂糖电泳，溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色观察梯度条带。LAMP反应中的产物是一系列具有不同长度的茎环结构DNA混合物，用凝胶电泳分析时会产生特异的梯状条带。（2）肉眼观察。在产物中加入SYBR Green I染料，呈现绿色即说明有目的扩增产物，这为现场病原体快速初筛提供了思路和可能。（3）通过对LAMP扩增副产物焦磷酸镁白色沉淀形成的浑浊程度进行判断。目前，已有公司成功开发出一种实时浊度检测仪，对靶序列可进行定量分析。（4）在LAMP扩增过程中加入染料，通过仪器实时观察颜色的变化而对靶序列进行定量分析。

3.3 与其他分子生物学技术的联合应用 LAMP技术可联合其他分子生物学技术。2013年，Wang等［32］应用原位LAMP，用于检测食物样本中的食源性副溶血性弧菌，与常规LAMP、PCR法进行了比较，结果证明原位LAMP是一种高敏感、高特异的检测方法。而Lang等［33］以Her-2/neu （c-erbB2）基因为靶标，通过LAMP进行基因扩增后利用荧光原位杂交的方法来检测乳腺癌的早期诊断，成本低廉。Hsieh等［34］采用一步法在现场利用微流控装置与LAMP技术结合进行沙门氏菌DNA的扩增，扩增过程实时监控，扩增时间少于1 h，建立了一种快速、敏感、定量的病原体DNA扩增方法。

目前，LAMP技术的研究重点是如何筛选特异性高的扩增引物，以及扩增产物检测的简便性、实时监控、准确性和反应速度。而标本核酸提取便捷性亦是科研工作者着力想解决的一个问题。LAMP技术具有操作简单、高特异性、高扩增效率、目的DNA判断简易、无需昂贵的仪器和试剂等优点，非常适用于即时检验初筛及现场的快速应急检测，是核酸研究领域的重要技术手段，在病原微生物的应急检测中必将发挥越来越大的作用。

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（2016-06-14 收稿 2016-09-08 修回）

（责任编辑 潘奕婷）

Progress on the application of loop-mediated isothermal amplification in detection of pathogenic microorganism

LIN Maorui， YANG Huawen， and CAO
Donglin. Department of Clinical Laboratory， The Second People's Hospital of Guangdong Province， Guangzhou 510317， China

CAO Donglin， E-mail： caodl@126.com

Loop-mediated isothermal amplification （LAMP） technology is a new nucleic acid isothermal amplification technology developed in recent years. Because of its high specificity， rapidity， and simplicity， it is very suitable for field detection and basic level detection and play an important role in public health emergencies. In this paper， the application of LAMP technology in detection of pathogenic microorganisms are briefly summarized.

loop-mediated isothermal amplification； pathogenic microorganism

R44

10.13919/j.issn.2095-6274.2016.10.014

2013年度广东省级财政技术研究开发与推广应用专项资金项目（粤财工［2013］401号）

林茂锐，本科学历，主管技师，E-mail： 269160833@qq.com

510317 广州，广东省第二人民医院检验科

曹东林，E-mail： caodl@126.com