人乳头瘤病毒HPV E6/E7mRNA检测用于宫颈癌术后随访的研究

方 恋，樊利芳，肖凤仪

（1.武汉大学医学院基础医学院，湖北 武汉 430060；2.湖北医药学院附属随州医院妇产科，湖北 随州 441300）

宫颈癌（Cervical cancer）是目前全世界范围内，妇女所患最常见的恶性肿瘤之一。现代医学研究表明高危型人乳头状病毒（HPV）的感染是妇女罹患宫颈病变及宫颈癌发生的重要因素[1]，其主要致病机制是位于HPV内部的E6/E7癌基因表达产生E6/E7癌蛋白，E6蛋白抑制p53而阻断凋亡，E7蛋白抑制pRB使细胞周期失控，致使细胞癌变的发生。而HPV E6/E7mRNA是E6/E7癌基因表达活动的直接产物，也是E6/E7癌蛋白合成的模板，是宫颈病变开始和进展的必要条件。因此，HPV E6/E7 mRNA检测是继HPV DNA检测之后的新一代宫颈病变评估方法，且通过对病毒癌基因的活动状态的检测来评估宫颈病变的风险程度，可能具有更高的特异性和阳性预测值。本研究对我院120例宫颈癌术后患者术后3个月内取脱落细胞行HPV E6/E7 mRNA的检测，并进行了为期18个月的随访跟踪，以探讨HPV E6/E7 mRNA检测在宫颈癌术后随访及评估复发风险的临床应用价值及优势。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2014年3月～2015年9月的120例已行宫颈癌手术且病理确诊为宫颈病变的患者。病例纳入标准：1）患者均符合术后复检标准，即术后3个月对其复诊时采集阴道脱落细胞；2）年龄在36～69岁；3）排除在3天内有阴道给药或阴道冲洗者；4）无内科免疫系统疾病及使用相关药物史；5）无化疗及盆腔放疗史；6）初次术后切缘阴性；7）对于以上各组研究对象的临床年龄、体重等一般指标进行对比统计分析后发现，差异无统计学意义（P＞0.05）。且在观察范围内的所有对象均给予签署相关知情同意书。8）临床随访资料完整。

1.2 方法

1.2.1 HPV E6/E7 mRNA拷贝数测定

使用专用刷在阴道残端逆时针旋转3圈，停留10 s，将得到的标本置于标本保存管中。采用分支链DNA（b-DNA)扩增技术对HPV E6/E7 mRNA进行检测,使用仪器试剂为科蒂亚生物技术有限公司生产的QuantiVirusTM冷光仪和HPV E6/E7 mRNA检测试剂盒。严格遵循试剂盒说明进行操作，以拷贝数＜ 1copy/ml 为阴性，≥1copy/ml 为阳性。

1.2.2 薄层液基细胞学检（TCT）

用TCT专用毛刷收集阴道残端的脱落细胞，按照国际癌症协会推荐的伯塞斯达系统（TBS）（2001）分类标准染色分类。

1.2.3 阴道镜检查及宫颈活检

由专职阴道镜医师用电子阴道镜观察，并于醋酸白试验和碘试验异常区行选择性多点组织检查（活检）或取阴道残端3,6,9,12点行常规活检。

1.2.4 随访检测

于术后3个月内进行HPV E6/E7 mRNA的检测，按检测结果分阴性及阳性组，并于术后6个月、12个月、18个月三时间点进行随访检测，行薄层液基细胞学检测（TCT）及阴道镜检查，阴道镜检阳性患者行组织病理活检。

1.2.5 复发判断标准

术后随访阴道残端病理诊断发现HPV E6/E7 mRNA检测阳性判断为复发。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0统计学软件进行分析，按照1.2.5所述复发判断标准版，计算HPV E6/E7 mRNA检测的敏感性 特异性阳性预测值 阴性预测值 和预测复发正确率。采用x2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

术后6、12、18个月的随访检测时累计发现病灶复发共计21例，残留/复发比例为17.5%（21/120）。

术后进行HPV E6/E7 检测的120名受试者有20名检测结果为阳性，此120名宫颈癌患者术后12个月后共有21人出现残留/复发。其预测率为95.23%（20/21）。

表1 120例宫颈癌患者随访前基本情况

表2 120例患者术后18个月累计随访检测结果

表3 E6E7mRNA 检测对术后预测残留/复发的诊断价值

3 讨 论

宫颈癌是现代女性生活危害妇女生命健康的一大疾患，现已升为妇科肿瘤第二大疾病，而感染HPV是公认的宫颈癌患者发病的重要原因。罹患宫颈癌（I-Ⅱa期）患者早期治疗以手术为主，其术后5年存活率较高，可达100%，但仍有部分患者出现术后复发的可能。而早期检查与早期手术干预,则极大地提高了宫颈癌患者的愈后,但是对于晚期以及术后复发的患者的治疗仍十分棘手。复发往往发生在具有高危因素的患者：如盆腔内有淋巴结转移、宫颈局部病变超过4cm者均为复发相关因素，且初次手术治疗后,患者是否会出现复发、什么时候复发以及复发部位均难以预测，误诊及临床分期不准确或许是其复发的原因之一。宫颈癌是目前治疗效果相对较好的妇科肿瘤，通常临床医师认为Ⅱa期以前的病例最好采取手术治疗，但临床上常发生不规范的手术治疗，如术前诊断不准确、临床分期不准确，使手术范围过小，从而导致术后复发。除上述因素外，宫颈癌预后差的原因还包括：患者年龄≦35岁、临床分期晚、原发肿瘤≧4cm，肿瘤的组织学类型不良及子宫颈深间质侵犯、淋巴毛细血管受侵、盆腔和腹主动脉旁淋巴结转移、宫旁组织受侵、阴道切缘阳性和子宫内膜受侵等因素。因此，有学者提出对早期宫颈癌患者，单一外科治疗不能使其生存期最大限度延长，为了提高疗效，必须对有复发危险因素的患者进行综合治疗，即新辅助化疗（NAC）和术后同步放化疗。但由于放化疗均有较大的副作用，如何评估宫颈癌术后患者的复发风险，筛选出须要接受术后同步放化疗的高风险患者就显得尤为重要。

目前常用的术后随访监测是通过HPV DNA检测，细胞学检测，阴道镜检测和组织病理活检。其中细胞学检测，阴道镜检测和组织病理活检只有当癌变已经发生后检测出来，无法作为预测术后复发风险的指标。HPV DNA检测通过检测病毒本身的存在评估宫颈病变，虽然具有较高的敏感性，但特异性相对较低，可检出过多的无临床意义感染（如一过性感染）。宫颈癌的关键病因是HPV E6/E7癌基因表达产生E6/E7癌蛋白（真正的致癌物质）。HPV E6/E7 mRNA是E6/E7癌基因表达活动的直接产物，也是E6/E7癌蛋白合成的模板，是宫颈癌变开始和进展的必要条件。持续性整合感染才会产生较多的E6/E7 mRNA, 进而产生较多的E6/E7癌蛋白，从而导致宫颈癌。HPV E6/E7 mRNA检测通过检测病毒致癌基因表达产生致E6/E7癌蛋白的活动及活动程度，评估宫颈术后复发风险，具有更高的特异性和阳性预测值。

HPV是一类亚型种类繁多，可感染阴道上皮鳞状细胞的双链DNA病毒。其中已确认特异HPV亚型的感染与肛门、生殖器鳞癌的发生有关，包括外阴、阴道、肛门、阴茎及头颈部癌[2-7]。大部感染者均能够自愈，但仍有部分人可持续存在，且最后发展为不同分型的宫颈病变，而高致病性的主要由高危HPVs所致[8]。

有研究表明[9]99.7%的宫颈癌患者的病变组织中都存在有HPV的感染，其阳性说明已有HPV的感染，但并不代表其已致癌变，只有反复感染或持续感染的患者才会进展[10]，这种感染人群机率很低，少于10%；这说明HPV DNA的检测可能会检测出较多无临床意义的感染，而对于识别HPV DNA是否存在有持续感染则显得成尤为重要；HPV E6/E7 mRNA的检测是对HPV DNA检测缺陷的弥补，因其检测的指标为宫颈细胞病变程度相关的病毒活动，因此HPV E6/E7 mRNA检测技术是近年来国际上最新推出的新一代检测靶标，其不仅对高危型HPV持续性感染的妇女有诊断价值，对于已行宫颈癌术后的患者同时也具有很高、很精准的临床诊断价值。Sotlar K等的研究表明，与HPV DNA检测相比，E6/E7 mRNA检测作为判断HPV与病变进展为宫颈癌的风险相关性的指标更有效[11]。

本研究中通过对120例宫颈癌术后的患者进行HPV E6/E7 mRNA方法检测，并在共计18个月的随访期间行TCT检测和阴道镜检测，阴道镜检阳性患者行组织病理活检。结果显示术后3个月内检测HPV E6/E7 mRNA阳性患者全部在18个月内出现残留/复发病灶，而术后E6/E7 mRNA阴性患者仅有1%（1/100）出现残留/复发病灶。对于预测术后复发风险，HPV E6/E7mRNA检测显示出非常高的特异度与阳性预测值，这一点与国外Benevolo[12]的研究结果也是相符的。此外，本研究随访期内同时进行了3次液基细胞学检测，但是仍有3例（2.5%）TCT结果阴性的患者活检证实出现病灶残留/复发，这3例患者E6/E7 mRNA检测均为阳性。另一方面，本研究中唯一1例E6/E7阴性活检出现复发患者 TCT结果为阳性，说明如果将TCT与HPV E6/E7 mRNA检测联合则可能更好的避免出现漏诊。

综上所述，笔者认为HPV E6/E7 mRNA能够用于评估宫颈癌患者术后复发风险，临床上建议针对术后E6/E7mRNA阳性患者加强随访监控，可尝试早期联合放化疗治疗方案积极地采取措施，以期降低宫颈癌患者术后复发率，并及时对于出现复发病灶患者进行治疗。

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