我国植物免疫诱导技术的研究现状与趋势分析

邱德文

(中国农业科学院植物保护研究所, 北京 100193)



我国植物免疫诱导技术的研究现状与趋势分析

邱德文

(中国农业科学院植物保护研究所, 北京 100193)

植物免疫诱导技术是近年来发展十分快速的新领域,本文从具有植物免疫诱导作用的蛋白质、壳寡糖和微生物诱导菌等方面介绍了我国植物免疫诱导技术的研究现状,阐述了植物免疫诱导剂的作用机理及诱导和提高植物免疫抗病的作用,分析了植物免疫诱导剂蛋白质生物农药、壳寡糖生物农药及微生物诱抗剂的发展趋势及应用前景。

植物免疫诱导剂; 蛋白质生物农药; 壳寡糖

植物免疫诱导剂是指没有直接的杀菌或抗病毒活性,但能够诱导植物免疫系统使植物获得或提高对病菌的抗性及抗逆性的药物或其代谢产物。植物免疫诱导剂一般分为两类：植物免疫诱导子(蛋白、寡糖、生物代谢产物或有机活性小分子)和植物免疫诱导菌(木霉菌、芽胞杆菌)。

植物免疫诱导子是指一类可以诱导寄主植物产生免疫抗性反应的活性分子,这种免疫抗性反应涉及植物生理生化、形态反应、植保素积累以及抗病基因表达等方面。诱导子从来源上可分为生物源和非生物源活性分子。生物源诱导子是指微生物、动、植物活体及其代谢产物,或寄主植物与病原菌互作产生的活性小分子,根据化学性质生物源诱导子可分为寡糖类诱导子、糖蛋白或糖肽类诱导子、蛋白类或多肽类诱导子以及脂类诱导子。这些诱导子通过与植物细胞表面的受体结合,激发植物的防御反应,使植物产生系统抗性。植物在生长过程中,会受到各种生物的和非生物的胁迫。为了生存和繁殖,植物必须对这些胁迫做出及时的和相应的反应。在植物受到病菌侵害时,过敏反应(hypersensitive response, HR)将被激活,造成病菌感染处的细胞死亡,从而能够限制病菌的扩散和营养的流失。同时,植物还通过系统获得抗性(SAR)的机制来保护自身。这种抗性远离一级、二级免疫反应的位点,以便保护植物免于病原菌的再次攻击。植物免疫所产生的信号传导主要包括有水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)和脱落酸(ABA)途径,调控植物抗病相关基因(resistance gene, R-gene)的表达,能够有效地防御大部分病原菌[1]。由于植物免疫代谢过程是由一个网络系统进行调控的,在这个网络调控中,植物抗性和植物生长的代谢也有交互影响,由此可见,在植物免疫诱导的过程中,除了抗性反应外,植物还会根据胁迫的种类和程度,主动调节自己的生理进程,包括发育和开花等。

1 我国植物免疫诱导技术的研究现状

1.1 具有植物免疫诱导作用蛋白质的研究现状

我国在蛋白质类植物免疫诱导剂的研究领域目前已处于国际领先水平,通过对微生物源蛋白诱导子的筛选、分离纯化、基因克隆与表达、蛋白质结构与功能研究,创建了“蛋白-基因-蛋白”的植物免疫诱导蛋白发掘技术平台。获得了10个有自主知识产权的免疫诱抗蛋白及基因克隆。“蛋白-基因-蛋白”筛选模式是以诱导植物提高免疫抗性为指标,从微生物发酵代谢产物中直接分离纯化天然目的蛋白,通过生物质谱技术和分子克隆技术获得蛋白的氨基酸序列和基因序列,进而获得表达蛋白,再检验表达蛋白与天然蛋白的诱抗活性是否一致。当前国际上通常采用的是从基因文库中通过基因表达筛选获得功能蛋白,经这一技术获得的功能蛋白只是蛋白质片段,完整蛋白的获得需要从基因文库中反复调取。而“蛋白-基因-蛋白”的创新模式克服了从基因文库反复调取基因片段不断拼接反复验证的多批次筛选的繁杂过程,从而加速了蛋白药物的筛选进程。该技术路线得到的靶标蛋白功能更明确,有利于直接筛选到具有生物活性的完整蛋白。目前,应用该创新筛选模式,已分别从极细链格孢(Alternariatenuissima)、稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)等病原真菌以及侧孢短芽胞杆菌(Brevibacilluslaterosporus)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)等生防细菌中分离获得了PeaT1、Hrip1、MoHrip1、MoHrip2、PemG1、PevD1、BcGS1、PebC1、PeBL1、PeBA1等10个植物免疫诱抗蛋白,为后续免疫蛋白质农药的开发积累了大量的蛋白资源。

创立了多功能、多指标的诱抗蛋白评价技术体系。通过对蛋白诱导子作用机理的研究,明确了蛋白诱导植物抗病和促生长的分子基础及信号转导途径[2-3]，确定了诱抗蛋白在烟草细胞膜上的蛋白结合位点[4];通过激活植物早期防御信号(pH上升、H2O2、NO)产生、诱导蛋白激酶以及防卫基因和蛋白的上调表达,最终使植物产生系统抗性[5-7]。基于免疫蛋白作用机制的研究,在诱抗蛋白评价体系中,创立了过敏性检测、TMV抗性、氧爆发、防卫基因上调表达、NO产生、细胞外液pH变化、植物促生长等多功能、多指标的诱抗蛋白评价技术体系。

我国已经自主研发了高效、低成本的免疫诱抗蛋白胶体磨剪切规模化生产新工艺,建立了年产能力800 t/年的蛋白质农药生产线。极细链格孢菌产生的免疫蛋白具有良好的诱导植物免疫抗性和促进植物生长的功能[2,8-12]。通过对极细链格孢菌天然菌株三级发酵工艺(培养基组分及比例、温度、pH、溶氧量等)的研究、免疫诱抗蛋白高效规模化生产工艺的优化(参数调整、各发酵阶段补料节点的确定等),使诱抗蛋白产率由原来的1.337 g/L提高到5.17 g/L,提高近4倍[13];通过发酵后处理、蛋白提取工艺及制剂加工工艺研究,建立了免疫诱抗蛋白制剂生产工艺。在后处理工艺中创建了胶体磨提取蛋白质的生产工艺(目前全球提取蛋白质工艺主要有超声波技术、高压细胞破碎技术和离心分离技术等),蛋白提取效率大幅度提高。根据植物多重免疫理论,在发酵液后处理过程中,保留了代谢物中的寡糖和多肽等增效成分,同时通过添加蛋白保护剂和科学配伍与优化,自主研发形成了高效低成本的免疫诱抗蛋白规模化生产线。在河南省安阳市汤阴高新区建立了国内首个三级发酵的蛋白质生产基地,该基地占地36 000 m2,生产车间3 000 m2,年产能力达到800 t/年。

1.2 新型糖类(壳寡糖)免疫诱导剂的研究现状

寡糖类植物免疫诱导剂在我国已有多年的研究与产业化基础,天然的壳寡糖、海藻糖等具有很好的诱导植物免疫、提高农作物抗病性的作用,植物与病原菌互作过程中释放的细胞壁寡糖片段具有诱导植物免疫系统、诱导植物抗病的功效,可开发为新型农用制剂。对此类诱导剂的研究与开发也成为当前国际植保学界的研究热点,相关产品也随之出现。壳聚糖存在于某些病原菌的细胞壁上,在植物与病原菌互作过程中,其降解产生的糖类片段可调控植物免疫产生抗性。壳聚糖具有原料广泛、易于降解等特点,因此目前已有大量以壳聚糖及其衍生物为原料的产品出现,如我国研发了壳聚糖生物制剂及其与免疫蛋白的复配农药制剂;壳聚糖已被韩国农林部认证为亲环境农作物生产的活性剂。到目前为止,已登录认证的壳聚糖及壳寡糖农业制剂产品共31件。我国目前已登记的糖类免疫诱导剂生物农药有80余项,但有效成分也多为壳寡糖。

实际上,除几丁质与壳聚糖外,在植物与病原菌相互作用过程中,植物与病原菌细胞壁还存在大量其他多糖,如植物细胞壁果胶多糖、真菌细胞壁葡聚糖等。国内外对于果胶及其降解产物寡聚半乳糖醛酸、真菌细胞壁多糖及其降解产物的活性已有一些报道,已明确了它们在植物上具有高效诱抗活性,寡聚半乳糖醛酸的作用机制也较为明确。但由于这些细胞壁糖类结构复杂,其清洁化生产工艺的缺乏、成本及应用技术等方面的问题,限制了这类产品的开发及相关产业的发展。

中国科学院大连化学物理研究所在寡糖农用制剂创制及应用推广方面有良好研究基础,从“十五”以来连续承担壳寡糖生物制备及其应用的多项科技项目,经多年研究积累已奠定雄厚的研究开发基础和队伍,在多糖降解酶创制、寡糖诱导植物免疫作用机制等方向上部分成果达到国际领先水平,累计发表研究论文200余篇,申请专利70余项,获海洋科技进步奖及辽宁省科技进步奖等奖励多项,被国内同行认为是国内寡糖制备技术及产品研发具有领先优势的科研机构。

研究团队以壳寡糖为原料,研制出多个寡糖植物免疫诱导剂及复配制剂,已获国家农药登记证11个,实现产业化并已在农业生产中推广335万hm2,在提高农作物产量和品质方面发挥了较大作用。研究团队在糖苷酶的创制和多糖可控降解方面具有多年的研究经验,前期通过对多种来源的产酶菌株进行筛选,再利用基因工程的改造方法,已成功创制了高活性、高专一性的糖苷水解酶数十种,结合生物化工方法,成功实现壳聚糖的可控降解及壳寡糖的大规模生产制备。进一步建立了糖类植物免疫诱导剂的活性筛选技术平台并深入进行了作用机制研究,提出了“糖链植物疫苗”概念,建立了壳寡糖针对不同作物的应用技术[14]。这些前期研究过程中建立的糖苷酶筛选改造平台、寡糖可控制备及分析检测技术平台、诱抗活性筛选平台等都为新型细胞壁寡糖免疫诱导剂的研究与开发提供了坚实的基础。

1.3 微生物诱抗菌的研究现状

微生物诱抗菌是指本身或其代谢产物能够激发植物自身免疫系统从而使植物获得抗病及抗逆性能的微生物,属于生物源诱导菌。其中,木霉菌是国际开发和应用历史悠久的生物防治微生物,分布极为广泛。木霉菌是广泛存在于土壤中的有益微生物,其在全球已有多年的研究与应用历史,在我国也已有多个生产厂家登记注册和产品推广应用。近年来,随着植物免疫诱导抗性研究的快速发展,我国上海交通大学科研团队研究证实, 木霉菌自身及其代谢产物均具有诱导植物免疫提高农作物抗性的作用,其生长过程中分泌丝氨酸蛋白酶、22 kD木聚糖酶、几丁质脱乙酰基酶、几丁质酶Chit42、SnodProt1蛋白(SnodProt1、Sm1和EPI)、脂肽、棒曲霉素类蛋白、无毒基因蛋白等，从而具有明显的增强植物免疫力和促进植物生长的功能[15]。生物源诱导菌如木霉菌和枯草芽胞杆菌等均可诱导植物发生MTI(microbe trigger immunity)反应,而一些专化性诱导子具有无毒基因(avr)的功能,可与植物的抗性基因(R)特异互作,诱导植物产生免疫反应,即一种ETI(effector trigger-immunity)反应。由此可见,木霉和枯草芽胞杆菌等是一类具有广泛应用前景的生物源诱导菌。

生物源诱导菌-木霉主要是来自5个木霉菌种：绿木霉(Trichodermavirens)、绿色木霉(T.viride)、哈茨木霉(T.harzianum)、棘孢木霉(T.asperellum)和深绿木霉(T.aureoviride)。Sm1/EPl1是木霉菌中的典型生物源诱导子,这2种诱导子均属于cerato-palanin(CP)家族成员。研究表明,Sm1晶体结构具有Φ-β-桶状折叠,木霉菌可通过这一结构域识别植物或真菌细胞壁寡糖,从而诱导植物产生免疫反应提高植物抗病性。木霉菌作为生物源诱导菌也与诱导子一样所诱导的植物免疫为系统获得抗性(SAR)。生物源诱导菌绿木霉所分泌的Sm1主要是单体具有诱导植物免疫的活性,EPl1是二聚体无植物免疫诱导活性。

近年来,我国关于木霉菌源蛋白农药相关研究主要集中在上海交通大学、浙江大学、哈尔滨工业大学、山东省科学院等单位。上海交通大学采用木霉菌突变株构建、蛋白活性分析、编码蛋白基因功能分析、蛋白互作、蛋白质组与转录组分析等方法获得多个具有诱导抗性功能的诱导子蛋白,明确了作用机理。如Sm1、纤维素酶蛋白、疏水蛋白等,对玉米免疫系统和防御反应酶系具有系统的诱导作用[16]。浙江大学研究了4个木霉菌株产木聚糖酶的条件,并以水稻纹枯病为病害系统,研究木霉菌株NF9及其木聚糖酶的诱导抗性[17]。主要研究结果如下: (1)4个生防木霉菌株NF9、P1、CT22、TC3产木聚糖酶的条件;(2)生防木霉NF9孢子悬浮液及其木聚糖酶粗提液均诱导水稻对纹枯病的抗性;(3)两种浓度(106个/mL和107个/mL)孢子悬浮液处理,诱导抗性无显著差异;(4)木霉NF9处理的干重与根冠比均高于对照,干重与根冠比分别比对照提高了12.1%和32.4%,而木霉NF9的木聚糖酶粗提液处理的水稻的干重、根冠比与对照差异不显著。东北林业大学研究了生防菌棘孢木霉(Trichodermaasperellum)T4菌株小分子疏水蛋白hyb2的功能,克隆获得hyb2的全长cDNA和DNA序列,克隆获得的棘孢木霉小分子疏水蛋白hyb2 结构是由2 个邻近的β-发夹组成的核心β-桶和1 个α-螺旋组成,这个与上述疏水蛋白结构一致。通过分析,确定了克隆棘孢木霉的hyb2属于Ⅱ型疏水蛋白[18]。青岛农业大学通过基因重组技术获得了原核表达较高活性的几丁质酶蛋白[19]。哈尔滨工业大学分别构建了棘孢木霉T4和球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)W7菌丝体的cDNA文库[20]。

2 我国植物免疫诱导剂的发展趋势和前景分析

近年来,植物免疫诱抗剂的研发与应用使植物病虫害的绿色防控又有了新的突破。利用免疫诱导技术提高植物自身抗性,是有害生物绿色防控的新技术和新方法,能大幅度减轻病虫害发生,减少或免用化学农药,是解决环境污染、农产品安全、实现农药零增长的有效途径,成为作物健康解决方案的重要基础,在作物病虫害综合防治以及增产增收计划中发挥越来越重要的作用。随着全民对食品安全、粮食安全和环境安全问题的逐渐重视以及政府对化学农药的限制使用政策,免疫诱抗剂不仅在粮食作物、果蔬等作物病虫害综合防控中的需求逐渐增大,而且广大用户的接受程度也在不断增强,由此带动了免疫诱抗剂产业的迅速发展。

植物激活剂能刺激植物自身系统获得抗病性能,是今后植物保护的新方向和新领域,商品化的植物激活剂有苯并噻二唑(BTH)、噻酰菌胺(TDL)、2,6-二氯异烟酸(INA)、N-氰甲基-2-氯异烟酰胺(NCI)、烯丙异噻唑(probenazole)、茉莉酸甲酯(MeJA)、异噻菌胺(isotianil)等[21-22]。Yoshioka等[23]合成了含有BTH阳离子结合阴离子的新盐衍生物改变了所得产物的物理性质和抗菌性能,同时保留了系统获得抗病性的诱导性能。该药剂由于生产成本高昂而未能在全球普及。噻酰菌胺(TDL)是稻瘟病防治药剂,能诱导烟草植株抗性基因的表达[24],并能代谢产生具有诱导抗病活性的4-甲基-1,2,3-噻二唑-5-甲酸[25]。异噻菌胺可激发水稻的天然防御机制防治稻瘟病[26]。这两个品种仅在日本应用较多,在其他地区应用受到种植结构等因素的限制。此外,美国生物农药公司(Marrone Bio Innovation, MBI)的虎杖提取物也具有很好的诱导抗病活性,该药剂目前由先正达在全球销售。

作为一类新型的多功能生物农药,已有部分产品(如蛋白诱导子、寡糖、脱落酸、枯草芽胞杆菌及木霉菌等)分别以植物免疫诱导剂蛋白质生物农药、壳寡糖生物农药及微生物诱抗剂等,在国内管理部门登记注册,并得到大面积的推广应用。这些免疫诱抗药物的共同突出特点是它们不同于传统的杀菌剂,并不直接杀死病原菌,而是通过调节植物的新陈代谢,诱导植物自身的免疫系统和生长系统,增强植物产生广谱性的抗病、抗逆能力。由中国农业科学院植物保护研究所根据植物免疫诱导技术最新研究成果开发出来的全球第一个抗植物病毒病蛋白质生物农药6%寡糖链蛋白可湿性粉剂(商品名称:阿泰灵),2014年获得农药登记证上市以来,受到了广大农户的好评, 经田间试验示范表明：该药对农作物病毒病的防控效果达70%以上,优于市场上现有的抗病毒剂药物的效果(30%～40%);提高粮食作物、蔬菜、水果和茶叶产量10%以上。植物免疫诱抗剂农药的研发正在成为当今国际新型生物农药的重要发展方向,并将迅速成为具有巨大发展前景的新型战略产业。该领域的研究将对国际植物保护重大基础理论研究做出重要贡献,大大提升我国在植物免疫领域的地位和实力,对我国农业的可持续发展、生态环境保护、粮食和食品安全具有十分重要的意义。

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(责任编辑：田 喆)

Research status and trend analysis of plant immune induction technology in China

Qiu Dewen

(Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

Plant immune induction technique is a new research field with rapid development in recent years. This paper introduced the research status of plant immune induction technology in China from the aspects of immune induced protein, chitosan oligosaccharide and microbial biopesticide. The action mechanism of the plant immune induction agent and the function of inducing and enhancing the plant immune resistance against plant diseases were expounded, and the development trend and application prospect of protein bio-pesticide, chitosan-oligosaccharide and microbial induced resistance agent were also analyzed in this review.

plant immune inducer; protein biological pesticide; chitosan-oligosaccharide

2016-08-19

2016-08-25

国家自然科学基金(31371984)

S 482.899

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.05.002

联系方式 E-mail:qiudewen@caas.cn