甘蔗重要病害分子检测技术

李文凤, 王晓燕, 黄应昆, 单红丽, 张荣跃, 尹 炯, 罗志明

(云南省农业科学院甘蔗研究所, 云南省甘蔗遗传改良重点实验室, 开远 661699)



甘蔗重要病害分子检测技术

李文凤, 王晓燕, 黄应昆*, 单红丽, 张荣跃, 尹 炯, 罗志明

(云南省农业科学院甘蔗研究所, 云南省甘蔗遗传改良重点实验室, 开远 661699)

快速有效地对甘蔗重要病害病原进行诊断检测,明确监测病害的病原是科学有效防控甘蔗病害的基础和关键。云南省农业科学院甘蔗研究所通过探索研究、改进创新、优化建立了甘蔗黑穗病、锈病、白条病、宿根矮化病、赤条病、花叶病、斐济病、黄叶病、杆状病毒病和白叶病等10种重要病害13种病原的分子快速检测技术,为甘蔗病害的有效诊断和防控、脱毒健康种苗检测及引种检疫提供了技术支撑。

甘蔗; 重要病害; 分子检测

在推进现代甘蔗产业过程中,甘蔗病害是甘蔗生产最大的威胁之一。尤其近年来,境外引种、蔗区间相互频繁调种,为甘蔗重要病害的传播蔓延提供了条件,再加上蔗区生态的多样化和复杂化,病原致病性的分化,导致蔗区甘蔗病害病原种类复杂多样,给我国的甘蔗安全生产带来了严重隐患[1-7]。对不同生态蔗区甘蔗重要病害病原进行适时、有效地诊断检测,探明主要病害病原种类、主要株系(小种)类群及其遗传多样性,明确监测病害的病原是科学有效防控甘蔗病害的基础和关键[8]。

近年来,云南省农业科学院甘蔗研究所在国家和云南省甘蔗产业技术体系“甘蔗病害检测技术研究”等项目支持下,开展了甘蔗病毒病、宿根矮化病、黑穗病和锈病等主要病害快速检测技术的研究,建立并优化了甘蔗黑穗病、锈病、宿根矮化病、花叶病、黄叶病、杆状病、条纹花叶病和白叶病等重要病害分子快速检测技术,为甘蔗病害的有效诊断和防控、脱毒健康种苗检测及引种检疫提供了技术支撑。现将上述各病害检测技术介绍如下。

1 甘蔗黑穗病(smut)PCR检测技术

1.1 DNA的提取

取0.5 g 甘蔗黑穗病菌(UstilagoscitamineaSydow)孢子或病部组织于研钵中,加入液氮研磨成粉状。采用DNA Kit植物DNA提取试剂盒提取叶片总DNA,具体步骤按照说明书操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析仪鉴定DNA质量。

1.2 扩增甘蔗黑穗病菌的特异性引物

引物序列采用文献[9]报道的根据甘蔗黑穗病菌(U.scitaminea)基因组bE交配型基因核苷酸保守序列设计的特异性引物,其序列为上游引物bE4:5′-CGCTCTGGTTCATCAACG-3′; 下游引物bE8:5′-TGCTGTCGATGGAAGGTGT-3′,目的片段长度为420 bp。

1.3 PCR检测

25 μL PCR扩增体系中含10×PCR buffer 2.5 μL,25 mmol/L MgCl22.0 μL,10 mmol/L dNTPs 1.0 μL,Taq(5 U/μL) 0.2 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各2.0 μL,DNA 模板2 μL,加灭菌超纯水至25 μL。PCR 反应程序:94℃预变性4 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min 延伸,35个循环;最后72℃ 延伸10 min。每个样品进行3次重复扩增检测。

1.4 结果及判别

取10 μL PCR 反应产物于1.0 % 琼脂糖凝胶上电泳,用BIO-RAD凝胶成像系统观察、判别结果,扩增出420 bp条带的为阳性,未扩增出420 bp条带的为阴性。

2 甘蔗锈病(orange rust和brown rust)PCR检测技术

2.1 甘蔗橙锈病菌[Puccinia kuehnii(Kruger)Butler]PCR检测技术

2.1.1 DNA的提取

取甘蔗橙锈病病叶0.2 g,采用DNA Kit植物DNA提取试剂盒提取叶片总DNA,具体步骤按照说明书操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析仪鉴定DNA质量。

2.1.2 扩增甘蔗橙锈病菌的特异性引物

引物序列采用文献[10]报道的根据甘蔗橙锈病菌(P.kuehnii)基因组 ITS 区域保守序列设计的特异性引物,其序列为上游引物Pk1-F:5′-AAGAGTGCACTTAATTGTGGCTC-3′;下游引物Pk1-R:5′-CAGGTAACACCTTCCTTGATGTG-3′,目的片段长度为527 bp。

2.1.3 PCR检测

25 μL PCR扩增体系中含ddH2O 10 μL、2×PCRTaq混合物12.5 μL、DNA模板0.5 μL、上、下游引物(20 μg/μL)各1.0 μL。PCR反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,56℃退火1 min,72℃延伸30 s,35个循环;最后72℃延伸7 min。每个样品进行3次重复扩增检测。

2.1.4 结果及判别

取10 μL PCR 反应产物于1.5 % 琼脂糖凝胶上电泳,用BIO-RAD凝胶成像系统观察、判别结果,扩增出527 bp条带的为阳性,未扩增出527 bp条带的为阴性。

2.2 甘蔗褐锈病菌(Puccinia melanocephala H.Sydow & P.Sydow)PCR检测技术

2.2.1 DNA的提取

取甘蔗褐锈病病叶0.2 g,采用DNA Kit植物DNA提取试剂盒提取叶片总DNA,具体步骤按照说明书操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析仪鉴定DNA质量。

2.2.2 扩增甘蔗褐锈病菌的特异性引物

引物序列采用文献[10]报道的根据甘蔗褐锈病菌P.melanocephala基因组ITS 区域保守序列设计的特异性引物,其序列为上游引物Pm1-F:5′-AATTGTGGCTCGAACCATCTTC-3′;下游引物Pm1-R:5′-TTGCTACTTTCCTTGATGCTC-3′,目的片段长度为480 bp。

2.2.3 PCR检测

25 μL PCR扩增体系中含ddH2O 10 μL、2×PCRTaq混合物12.5 μL、DNA模板0.5 μL、上、下游引物(20 μg/μL)各1.0 μL。PCR反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,56℃退火1 min,72℃延伸30 s,35个循环;最后72℃延伸7 min。每个样品进行3次重复扩增检测。

2.2.4 结果及判别

取10 μL PCR 反应产物于1.5 % 琼脂糖凝胶上电泳,用BIO-RAD凝胶成像系统观察、判别结果,扩增出480 bp条带的为阳性,未扩增出480 bp条带的为阴性。

3 甘蔗白条病(leaf scald)PCR检测技术

3.1 样品采集与处理

于甘蔗成熟期采样检测,采用五点取样法,每个样品取10株,每株截取中下部茎节各1节,每节切成约7 cm长,纵向“十字”剖为4份,再用钳子挤压蔗茎,共取约25 mL的蔗汁于50 mL离心管内混匀,样品放于冰箱中,于-20℃保存待用。每取一个样品后,取样工具先用清水冲洗,再用75%乙醇进行消毒。

3.2 样品制备

取采集的蔗汁1.5 mL放入离心管中,13 000 r/min离心3 min,弃上清液,向沉淀中加入1 000 μL灭菌水,13 000 r/min重复操作2次,向沉淀中加入20～200 μL灭菌水,-20℃保存备用。

3.3 扩增甘蔗白条病菌的特异性引物

引物序列采用文献[11]报道的根据甘蔗白条病菌[Xanthomonasalbilineans(Ashby) Dowson]基因组保守序列设计的特异性引物,其序列为上游引物XaF:5′-CCTGGTGATGACGCTGGGTT-3′;下游引物XaR:5′-CGATCAGCGATGCACGCAGT-3′,目的片段长度为600 bp。

3.4 PCR检测

25 μL PCR扩增体系中含10× PCR buffer 2.5 μL,25 mmol/L MgCL22.0 μL,10 mmol/L dNTPs 1.0 μL,上、下游引物(20 μg/μL)各0.5 μL,5UTaq聚合酶 0.2 μL,DNA模板1.0 μL,ddH2O 17.3 μL。PCR反应条件为:95℃ 5 min;94℃ 45 s,65℃ 1 min,72℃ 1 min,10 个循环;94℃ 45 s,65℃ 1 min,72℃ 2 min,10个循环;94℃ 45 s,65℃ 1 min,72℃ 3 min,10 个循环;72℃ 10 min。每个样品进行3次重复扩增检测。

3.5 结果及判别

取10 μL PCR 反应产物于1.0 % 琼脂糖凝胶上电泳,用BIO-RAD凝胶成像系统观察、判别结果,扩增出600 bp条带的为阳性,未扩增出600 bp条带的为阴性。

4 甘蔗宿根矮化病(RSD)PCR检测技术

4.1 样品采集与处理

与甘蔗白条病相同。

4.2 DNA的提取

每个样品取2 000 μL蔗汁放入离心管中,12 000 r/min离心10 min,弃上清液。采用DNA Kit植物DNA提取试剂盒提取叶片总DNA,具体步骤按照说明书操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析仪鉴定DNA质量。

4.3 扩增甘蔗宿根矮化病菌的特异性引物

引物采用文献[12]报道的根据甘蔗宿根矮化病菌[Leifsoniaxylisubsp.xyli(Lxx)]16S-23S rDNA基因间隔区保守序列设计的特异性引物,其序列为上游引物Lxx1:5′-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3′,下游引物Lxx2:5′-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3′;目的片段长度为438 bp。

4.4 PCR检测

20 μL PCR扩增体系中含ddH2O 8.6 μL,2×PCRTaqmix 8 μL,DNA模板3 μL,上、下游引物(20 μg/μL)各0.2 μL;PCR反应程序为:95℃预变性5 min;94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸5 min。每个样品进行3次重复扩增检测。

4.5 结果及判别

取10 μL PCR 反应产物于1.0 % 琼脂糖凝胶上电泳,用BIO-RAD凝胶成像系统观察、判别结果,扩增出438 bp条带的为阳性,未扩增出438 bp条带的为阴性。

5 甘蔗赤条病(red stripe)PCR检测技术

5.1 DNA的提取

取0.2 g甘蔗叶片,加入液氮研磨成粉状。采用DNA Kit植物DNA提取试剂盒提取叶片总DNA,具体步骤按照说明书操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析仪鉴定DNA质量。

5.2 扩增甘蔗赤条病菌的特异性引物

引物序列采用文献[13]报道的根据甘蔗赤条病菌[Xanthomonasrubrilineans(Leeetal.)StarretBurkh.]16S-23S rDNA基因间隔区保守序列设计的特异性引物,其序列为上游引物P0f:5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;下游引物P6r:5′-CTACGGCAACCTTGTTACGA-3′,目的片段长度为1 500 bp。

5.3 PCR检测

25 μL PCR扩增体系中含ddH2O 11.0 μL、2×PCRTaq混合物12.5 μL、DNA模板1.0 μL、上、下游引物(10 μg/μL)各0.25 μL。PCR反应程序为:95℃预变性5 min;95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,25个循环;最后72℃延伸7 min。每个样品进行3次重复扩增检测。

5.4 结果及判别

取10 μL PCR 反应产物于1.5 % 琼脂糖凝胶上进行电泳,用BIO-RAD凝胶成像系统观察、判别结果,扩增出1 500 bp条带的为阳性,未扩增出1 500 bp条带的为阴性。

6 甘蔗花叶病(SCMV, SrMV和SCSMV)RT-PCR检测技术

6.1 甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)RT-PCR检测技术

6.1.1 RNA的提取

取新鲜叶片0.1 g于研钵中,加入液氮研磨成粉状。采用RNA Kit植物RNA提取试剂盒提取叶片总RNA,具体步骤按照说明书操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析仪鉴定RNA质量。

6.1.2 扩增SCMV的特异性引物

引物为本实验室根据GenBank登录的SCMV外壳蛋白(CP)基因保守序列设计的特异性引物,其序列为上游引物SCMV-F:5′-GATGCAGGVGCHCAAGGRGG-3′;下游引物SCMV-R:5′-GTGCTGCTGCACTCCCAACAG-3′,目的片段长度为924 bp。

6.1.3 RT-PCR检测

用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix试剂盒进行反转录。反转录程序:10 μL RT体系中含2×TS reaction mix 5μL、DEPC水1.5 μL、0.5 μg/μL Oligod (T)180.5 μL、RT/RI enzyme mix 0.5 μL、gDNA remover 0.5 μL、RNA 2.0 μL;RT反应条件是:25℃ 10 min,42℃ 30 min。PCR程序:20 μL PCR体系中含ddH2O 7.2 μL、2×PCRTaqmix 10 μL,cDNA模板2 μL,上、下游引物(20 μg/μL)各0.4 μL;PCR扩增程序都为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸10 min。每个样品进行3次重复扩增检测。

6.1.4 结果及判别

取10 μL PCR 反应产物于1.0 % 琼脂糖凝胶上电泳,用BIO-RAD凝胶成像系统观察、判别结果,扩增出924 bp条带的为阳性,未扩增出924 bp条带的为阴性。

6.2 高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)RT-PCR检测技术

6.2.1 RNA的提取

取新鲜叶片0.1 g于研钵中,加入液氮研磨成粉状。采用RNA Kit植物RNA提取试剂盒提取叶片总RNA,具体步骤按照说明书操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析仪鉴定RNA质量。

6.2.2 扩增SrMV的特异性引物

引物为本实验室根据GenBank登录的SrMV外壳蛋白(CP)基因保守序列设计的特异性引物,其序列为上游引物SrMV-F:5′-CATCARGCAGGRGGCGGYAC-3′;下游引物SrMV-R:5′-TTTCATCTGCATGTGGGCCTC-3′,目的片段长度为828 bp。

6.2.3 RT-PCR检测

用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix试剂盒进行反转录。反转录程序:10 μL RT体系中含2×TS reaction mix 5 μL、DEPC水 1.5 μL、0.5 μg/μL Oligod (T)180.5 μL、RT/RI enzyme mix 0.5 μL、gDNA remover 0.5 μL、RNA 2.0 μL;RT反应条件是:25℃ 10 min,42℃ 30 min。PCR程序:20 μL PCR体系中含ddH2O 7.2 μL、2×PCRTaqmix 10 μL,cDNA模板2 μL,上、下游引物(20 μg/μL)各0.4 μL;PCR扩增程序都为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸10 min。每个样品进行3次重复扩增检测。

6.2.4 结果及判别

取10 μL PCR 反应产物于1.0 % 琼脂糖凝胶上电泳,用BIO-RAD凝胶成像系统观察、判别结果,扩增出828 bp条带的为阳性,未扩增出828 bp条带的为阴性。

6.3 甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)RT-PCR检测技术

6.3.1 RNA的提取

取新鲜叶片0.1 g于研钵中,加入液氮研磨成粉状。采用RNA Kit植物RNA提取试剂盒提取叶片总RNA,具体步骤按照说明书操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析仪鉴定RNA质量。

6.3.2 扩增SCSMV的特异性引物

引物为本实验室根据GenBank登录的SCSMV外壳蛋白(CP)基因保守序列设计的特异性引物,其序列为上游引物SCSMV-F:5′-ACAAGGAACGCAGCCACCT-3′;下游引物SCSMV-R:5′-ACTAAGCGGTCAGGCAAC-3′,目的片段长度为939 bp。

6.3.3 RT-PCR检测

用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix试剂盒进行反转录。反转录程序:10 μL RT体系中含2×TS reaction mix 5 μL、DEPC水 1.5 μL、0.5 μg/μL Oligod (T)180.5 μL、RT/RI enzyme mix 0.5 μL、gDNA remover 0.5 μL、RNA 2.0 μL;RT反应条件是:25℃ 10 min,42℃ 30 min。PCR程序:20 μL PCR体系中含ddH2O 9.6 μL、2×PCRTaqmix 8.0 μL,cDNA模板2 μL,上、下游引物(20 μg/μL)各0.2 μL;PCR扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸10 min。每个样品进行3次重复扩增检测。

6.3.4 结果及判别

取10 μL PCR 反应产物于1.0 % 琼脂糖凝胶上电泳,用BIO-RAD凝胶成像系统观察、判别结果,扩增出939 bp条带的为阳性,未扩增出939 bp条带的为阴性。

7 甘蔗斐济病(Fiji disease)RT-PCR检测技术

7.1 RNA的提取

取新鲜叶片0.1 g于研钵中,加入液氮研磨成粉状。采用RNA Kit植物RNA提取试剂盒提取叶片总RNA,具体步骤按照说明书操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析仪鉴定RNA质量。

7.2 扩增甘蔗斐济病毒的特异性引物

引物采用文献[13]报道的根据甘蔗斐济病毒(Sugarcanefijidiseasevirus,SFDV)片段9(S9)基因组保守序列设计的特异性引物,其序列为上游引物FDV7F:5′-CCGAGTTACGGTCAGACTGTTCTT-3′;下游引物FDV7R:5′-CA GTGGTGACGAAAT GATGGCGA-3′,目标片段长度为450 bp。

7.3 RT-PCR检测

采用C.therm RT-PCR试剂盒进行一步法RT-PCR检测。于0.5 mL PCR管中加入1.0 μL RNA模板,上、下游引物(20 μg/μL)各0.25 μL,ddH2O 11.0 μL。将以上混合物在PCR仪上加热至99℃变性2 min,然后立即置于冰上。在以上变性混合液中依序加入5×buffer 5 μL,10%PVP 2.5 μL,100 mmol/L DTT 1.25 μL,100%DMSO 1.25 μL,5% BSA 1.0 μL,20 mmol/L dNTPs 0.5 μL,C.therm酶 1.0 μL,反应总体积为25 μL。PCR反应条件为:57℃ 30 min;95℃ 2 min;95℃ 1 min,57℃ 1 min,72℃ 1 min,35循环;72℃ 8 min。每个样品进行3次重复扩增检测。

7.4 结果及判别

取10 μL PCR 反应产物于1.5 % 琼脂糖凝胶上电泳,用BIO-RAD凝胶成像系统观察、判别结果,扩增出450 bp条带的为阳性,未扩增出450 bp条带的为阴性。

8 甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)RT-PCR检测技术

8.1 RNA的提取

取新鲜叶片0.1 g于研钵中,加入液氮研磨成粉状。采用RNA Kit植物RNA提取试剂盒提取叶片总RNA,具体步骤按照说明书操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析仪鉴定RNA质量。

8.2 扩增ScYLV的特异性引物

引物为本实验室根据GenBank登录的ScYLV外壳蛋白(CP)基因保守序列设计的特异性引物,其序列为上游引物ScYLV-F:5′-AATCAGTGCACACATCCGAG-3′;下游引物 ScYLV-R:5′-GGAGCGTCGCCTACCTATT-3′,目的片段长度为634 bp。

8.3 RT-PCR检测

采用One Step RNA PCR Kit(大连TaKaRa公司)进行SCYLV CP基因RT-PCR扩增。按序加入ddH2O 6.2 μL、PrimeScript 1 step enzyme mix 0.8 μL、2×1 step buffer 10.0 μL、上、下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL、RNA模板2.0 μL于PCR管里,低速离心几秒混匀后放入PCR仪。45℃ 30 min;94℃ 2 min;94℃ 30 s,52℃ 30 s,70℃ 1 min,30个循环;70℃ 5 min。每个样品进行3次重复扩增检测。

8.4 结果及判别

取10 μL PCR 反应产物于1.0% 琼脂糖凝胶上电泳,用BIO-RAD凝胶成像系统观察、判别结果,扩增出634 bp条带的为阳性,未扩增出634 bp条带的为阴性。

9 甘蔗杆状病毒病(Sugarcane bacilliform virus,SCBV)PCR检测技术

9.1 DNA的提取

取甘蔗叶组织0.3～0.5 g加适量液氮研磨至粉状,转至2 mL离心管中。采用DNA Kit植物DNA提取试剂盒提取叶片总DNA,具体步骤按照说明书操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析仪鉴定DNA质量。

9.2 扩增SCBV的特异性引物

引物参照文献[15]报道的根据SCBV基因组保守区域设计的特异性引物,其序列为上游引物PC1:5′-ACCAGATCCGAGATTACAGAAG-3′;下游引物PC2:5′-TCACCTTGCCAACCTTCATA-3′,目的片段长度为589 bp。

9.3 PCR检测

在PCR管中按序加入ddH2O 7.6 μL、2×PCRTaqmix 10 μL、DNA模板2 μL、上、下游引物(20 μmol/L)各0.2 μL;加完后低速离心10 s后放进PCR仪,94℃预变性2 min,94℃变性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸1 min,30个循环后72℃延伸5 min。每个样品进行3次重复扩增检测。

9.4 结果及判别

取10 μL PCR 反应产物于1.0% 琼脂糖凝胶上电泳,用BIO-RAD凝胶成像系统观察、判别结果,扩增589 bp条带的为阳性,未扩增出589 bp条带的为阴性。

10 甘蔗白叶病植原体(Sugarcane white leaf phytoplasma)巢式 PCR检测技术

10.1 DNA的提取

取0.2 g甘蔗叶片,加入液氮研磨成粉状。采用DNA Kit植物DNA提取试剂盒提取叶片总DNA,具体步骤按照说明书操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析仪鉴定DNA质量。

10.2 扩增SCWL植原体的引物

引物采用文献[16]报道的扩增植原体16S rDNA基因的通用引物对P1/P7和R16F2n/ R16R2,其序列为P1:5′-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3′,P7:5′-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3′,目的片段长度为1 840 bp;R16F2n:5′-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3′;R16R2:5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAA CCCCG-3′,目的片段长度为1 240 bp。

10.3 巢氏PCR检测

以P1/P7为引物进行第1次PCR扩增,PCR反应体系为25 μL:总基因组DNA 1 μL,10×PCR buffer 2.5 μL,P1(20 μmol/L)1 μL,P7(20 μmol/L)1 μL,MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL,dNTPs(10 mmol/L)2.0 μL,Taq酶(5 U/μL)0.2 μL,ddH2O 15.3 μL。第1次PCR扩增程序为:94℃预变性3 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。第2次PCR反应体系25 μL:取1 μL第1次PCR扩增产物(稀释30倍)作为模板DNA,R16F2n(20 μmol/L)1 μL,R16R2(20 μmol/L)1 μL,其他试剂用量同第1次PCR扩增。第2次PCR扩增程序为:94℃预变性3 min;94℃变性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。每个样品进行3次重复扩增检测。

10.4 结果及判别

取10 μL PCR 反应产物于1.0 % 琼脂糖凝胶上电泳,用BIO-RAD凝胶成像系统观察、判别结果,扩增出1 240 bp条带的为SCWL阳性,未扩增出1 240 bp条带的为阴性。

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(责任编辑：田 喆)

Molecular detection techniques of sugarcane important diseases

Li Wenfeng, Wang Xiaoyan, Huang Yingkun, Shan Hongli, Zhang Rongyue, Yin Jiong, Luo Zhiming

(Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences; Yunnan Province Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Kaiyuan 661699, China)

Rapid and effective diagnosis detection for the pathogens of sugarcane important diseases and monitoring the pathogenic agents of the diseases are the foundation and key to scientific and effective controlling of sugarcane diseases. Through exploration research, improvement innovation and optimization, the rapid molecular detection techniques for 13 pathogens of 10 important diseases including sugarcane smut, rust, leaf scald, ratoon stunting, red stripe, mosaic, Fiji, yellow leaf, bacilliform virus and white leaf diseases were established by Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences. These could provide scientific basis for effective diagnosis and controlling of sugarcane diseases, detection for virus-free healthy seedling and quarantine for introducing seeds.

sugarcane; important diseases; molecular detection

2015-10-26

2015-12-09

国家现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-20-2-2)；云南省现代农业产业技术体系建设专项资金

S 435.661

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.05.021

* 通信作者 E-mail：huangyk64@163.com