光动力抗菌化学疗法治疗创伤感染的动物模型及疗效研究进展
2016-02-07刘子泉综述审校
袁 瑶，刘子泉 综述 丁 辉 审校
光动力抗菌化学疗法治疗创伤感染的动物模型及疗效研究进展
袁 瑶，刘子泉 综述 丁 辉 审校
抗生素的滥用致细菌耐药性问题日益严重，创伤感染的治疗也愈具挑战，目前针对耐药菌的治疗中光动力抗菌化学疗法（photodynamic antimicrobial chemotherapy，PACT）是一种很有发展前景的新策略。笔者就PACT在治疗创伤感染的动物模型、特点及各种光敏剂疗效进行归纳，以利于研究者选择适宜的模型工具、对同类光敏剂或动物模型的治疗疗效进行平行比较。
光动力抗菌化学疗法；动物模型；创伤感染；抗菌疗效
青霉素的问世开启了抗生素的“黄金时代”，然而病原微生物种类多样且变异迅速，新抗生素的研发速度远远赶不上病原微生物的变异步伐，再加上抗生素的滥用导致部分病原微生物出现了耐药性，尤其是“超级细菌”出现引起了世界的警觉甚至恐慌，因此，新型不易产生耐药性的抗菌药物和抗菌方法的研究已经迫在眉睫[1]。光动力灭菌法因其抗菌谱广、不易产生耐药性等优势已成为当前最有前途的新型抗耐药菌的治疗方式之一[2]，也被誉为“抗生素时代的终结者”[3]。
PACT依赖于光敏剂产生的活性氧物质对靶细胞的细胞膜、蛋白质、细胞核或其他细胞成分氧化损伤而产生光动力活性[4]。目前已被国内外批准上市的多种光敏药物多用于肿瘤、老年性眼底黄斑病变及光角化病等光动力治疗[5]，而对感染的临床治疗却处于空白阶段，因此，越来越多的抗感染实验研究蓬勃发展[6]。药物研发需合适的动物模型，为方便研究者根据实际需求选择适宜的模型工具，笔者就PACT在治疗创伤合并感染的动物模型、特点及各种光敏剂对其疗效进行归纳。
1 动物的选择
感染模型在动物的选择上存在着一些趋势，如最近PubMed上发表的18篇关于运用PACT介导的体内实验文章，有14篇选用Balb/c小鼠作为模型动物，仅有4篇选用Wistar大鼠、豚鼠及金色小仓鼠为模型动物。大动物模型在PACT领域还没被大量研究，这也为以后PACT研究提供了一个新方向[6]。动物模型以Balb/c小鼠居多，这可能与Balb/c小鼠为纯系实验动物、个体差异较小、免疫低下、造模成功率较高、一般无相互侵袭性及价格成本较低有关。但从感染模型的建造及后期光动力药物治疗疗效评价考虑，无论何种模型动物均应为单笼饲养，且保证足够的食物和水，动物的生长环境一般为（20±2）℃。感染愈合过程与年龄有很大关系，研究也证明了老龄动物伤口愈合速度明显延迟[7,8]，但是目前PACT治疗动物体内感染的研究中一般都选择年幼或生长发育期的动物作为研究工具，这对于研究感染在不同年龄群体的愈合过程还具有一定的局限性。
2 感染模型的选择及治疗疗效
皮肤创伤可引起皮下组织感染，在PACT治疗动物体内感染的模型选择上几乎全为皮肤创伤合并感染模型。皮肤创伤合并感染动物模型是以人类创伤发生的原因来建立的，从宏观水平肉眼观察愈合过程中所出现的症状（如皮肤溃疡、局部缺血或坏死、伤口不愈及愈后产生瘢痕等），微观水平评价伤口愈合效果（如提取创伤组织RNA、收集伤口渗出物、对痂下组织进行菌量计数等）来探究伤口愈合过程中的病理和生化指标变化，进而为探究伤口愈合机理及药物研发提供依据[9,10]。皮肤创伤合并感染动物模型大致可分为四种：皮肤切除感染模型、皮肤烧伤感染模型、皮肤擦伤感染模型和褥疮感染模型。菌株的选择大致分为两种，即为革兰阳性菌和（或）革兰阴性菌[6]。
2.1 皮肤切除感染模型 该模型主要指全层皮肤切除合并感染，即用打孔器、剪刀、手术刀或电刀等工具将皮肤的表皮和真皮切除，不破坏或破坏皮下筋膜层和肌肉，然后在伤口局部滴加菌株。该类创伤模型的优点在于操作简单，创伤原因明确，根据造模方法又可分为急性感染模型和慢性感染模型。
2.1.1 急性感染模型 2002年，Hamblin等[10]首次报道了运用PACT疗法治疗皮肤切除伤口合并感染的动物实验，其中细菌为基因工程发光细菌，这也开启了联合使用生物发光细菌和敏感的光学成像系统建立一种直接、实时、连续动态监测小鼠皮肤创口感染模型的先河。研究人员以浓度为100 μM的多聚赖氨酸二氢卟吩螯合物e6（poly-L-lysine-chlorin e6，PL-Ce6）结合波长为665 nm、能量密度为160 J/cm2的激光照射治疗被5×106/ml的大肠埃希菌感染的小鼠皮肤创面。结果显示由PL-Ce6介导的PACT治疗伤口细菌失活率可达到99%，且与其他局部抗/杀菌剂（如硝酸银、莫匹卡星、多黏菌素B）相比不危害宿主组织，细菌不对其产生抵抗。2003年，Hamblin等[11]再次报道运用与上述同结构的光敏药物PL-Ce6介导的PACT方法治疗感染铜绿假单胞菌的小鼠伤口。造模方法、单个伤口面积及所用菌量与上述报道相同，但光敏药物PL-Ce6的浓度提高到200 μM，能量密度增加至240 J/cm2。研究发现，PACT治疗组小鼠细菌失活率可达99%；未治疗组小鼠第5天全部死亡，而PACT治疗组存活率达90%；与滴加50 μl同等剂量的0.5% AgNO3治疗小组相比，PACT治疗组小鼠伤口愈合速度明显加快。我国学者Lu等[12]也曾在小鼠身上制造皮肤全层切除立即分别感染奇异变形杆菌和铜绿假单胞菌模型验证了新型富勒烯光敏药物BF6的体内抗菌疗效。
2.1.2 慢性感染模型 Simonetti等[13]研究了新型酞菁类抗菌药物苯二甲蓝氯化物介导的PACT治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）引起的小鼠感染模型。用蘸有5×107/ml细菌的薄纱覆盖伤口，感染的第2天在伤口局部均匀涂抹0.3%的RLP068/Cl凝胶，采用波长为698 nm、能量密度为60 J/cm2的激光光源进行照射，结果显示PACT治疗组细菌数量与未经治疗的对照组相比，显著下降约31og10。在感染的第9天，与抗生素替考拉宁组相比，PACT治疗组细菌数量显著下降约21og10。组织学检查显示PACT治疗组表现出一个连续的、完整的再上皮化过程。Nafee等[14]利用该模型验证了以金丝桃素为依托、以纳米粒为载体而合成的两性分子共聚物金丝桃素纳米制剂的药效。此外，Fu等[15]也用此类模型验证了新型β-内酰胺类光敏药物的药效。
2.2 皮肤烧伤感染模型 烧伤是指由外界温度在55℃以上的火焰、热液、气体或某些特殊的化学物质等与皮肤接触足够长的时间所引起的皮肤组织或黏膜的损伤。和其他皮肤损伤相比，烧伤较易合并感染，一方面是因为其破坏皮肤屏障功能、血流供应，继而导致免疫抑制；另一方面，温热潮湿的环境也是细菌孵育的“温床”[2,3]。烧伤合并感染模型一般选择在动物背部用一定面积的热金属铜块烫伤局部皮肤，烧伤面积占动物体表面积的5%～50%，烫伤时间为3～30 s，从而形成不同深度的烧伤模型，随后在局部伤口滴加目标菌株[16]。PACT介导的此类模型体内实验大多选择烫伤时间为10 s以建立三度烧伤。该创伤模型的优点在于创伤分级明确，不足之处为：（1）操作较复杂，除准备热铜块以外还得在造模结束后给予补液；（2）创伤原因不明确、愈合观察时间较长，因为烧伤不仅可造成皮肤变性坏死，还可导致血细胞和淋巴细胞变性，以致血管和淋巴管堵塞，造成烧伤组织修复区域的营养不良。
Orenstein等[17]使用豚鼠建立三度烧伤模型研究了卟啉氯化血红素复合物介导的PACT对108/ml的金黄色葡萄球菌感染的烧伤创面治疗疗效，发现金黄色葡萄球菌菌株减少了99%，但该化合物具有较强的暗毒性。Lambrechts等[18]用阳离子光敏剂卟啉氯化物结合波长为（635±15）nm、能量密度为210 J/cm2的红光照射治疗由108/ml的金黄色葡萄球菌感染的三度烧伤创面，发现98%以上的细菌能被杀灭，但同时观察到治疗后有细菌再生现象。Dai等[19]用多聚乙烯亚胺二氢卟吩螯合物e6（polyethylenimine-chlorin e6，PEI-Ce6）结合波长为（660±15）nm、能量密度为240 J/cm2的激光照射治疗由108/ml的多重耐药鲍曼不动杆菌感染的三度烧伤创面，发现感染后立即治疗要比感染后1 d及2 d后再治疗的疗效好。同时，由PEI-Ce6介导的PACT还可以促进伤口愈合。Hashimoto等[20]用浓度为10 μM的竹红菌素B金属配合物（Hypocrellin B with lanthanide ions，HB：La+3）结合能量密度为24 J/cm2的蓝光和红光分别照射治疗由3×109/ml的多重耐药铜绿假单胞菌感染的三度烧伤创面，结果显示HB：La+3结合蓝光和红光的治疗组能延迟菌血症的发生，使血液中细菌含量减少2～31og10，提高感染后24 h内小鼠生存率，有趣的是由蓝光激发的PACT组要比由红光激发的PACT组小鼠生存率更高。Huang等[21]也运用三度烧伤合并感染鲍曼不动杆菌模型验证了新型C70富勒烯衍生物光敏药物LC17、LC18的体内抗菌疗效，且LC18在体内抑菌方面略显优势，因为在同等条件下LC17介导的PACT在治疗后的第4天有菌量反弹现象并持续到第6天，而LC18组治疗后未观察到反弹现象。
2.3 皮肤擦伤感染模型 该模型只破坏动物表皮，由于小鼠皮肤较薄，表皮和真皮较难分离，建立该模型是用针状物进行皮肤的划拉。该创伤模型的优点在于创伤较小，愈合时间较快，但操作要求较高。我国Dai 等[22]最早运用此模型，其在小鼠背部制造了面积为1 cm×1 cm的6×6十字交叉伤口，以菌量为108/ml的MRSA进行感染，用浓度为400 μM的PEI-ce6结合波长为（600±15）nm的非相干光源进行治疗。与未治疗组相比，PACT组菌量下降了2.7log10，伤口愈合时间缩短了8.6 d。Vecchio等[23]用同等浓度400 μM的RLP068/Cl和甲苯胺蓝（toluidine blue O，TBO）结合激光治疗由108/ml的MRSA感染的小鼠擦伤伤口。与TBO介导的PACT治疗组及未治疗组相比，由RLP068/Cl介导的PACT治疗组MRSA被有效杀死（从治疗开始至结束后10 min内，RLP068/Cl介导的PACT治疗组菌量下降2.91og10，TBO介导的PACT治疗组菌量下降1.0log10）并可抑制其再生，同时也可促进伤口的愈合（治疗后4～9 d，RLP068/Cl介导的PACT治疗组伤口愈合面积为78%，TBO介导的PACT治疗组为24%，非治疗组为0）。随后Zhang等[24]也运用皮肤擦伤感染60 μl 107菌落形成单位鲍曼不动杆菌模型验证了新型C60富勒烯光敏药物LC16的体内抗菌疗效。
2.4 皮肤褥疮感染模型 褥疮是机体某一部位长期受压使血液循环受阻，发生持续的缺血缺氧和营养不良而致的皮肤和深部组织溃疡，在长期卧床及全身营养不良的老人中较为常见。在目前发表的文献中，该模型还比较少见，但不排除这会成为未来研究的一个热点。该创伤模型要求制备特殊压力装置，对组织损伤较大，造模时间较长。2013年，Lanzafame等[25]阐述了褥疮溃疡感染模型的建造及PACT疗法的抗菌效果。其在小鼠皮下置入金属片，皮肤表面施加磁铁，施压12 h解压12 h造成缺血再灌注，连续3 d，以菌量为108/ml 的MRSA进行感染，新型以胶原包被的黄素类光敏剂（photoactivated collagen-embedded flavins，PCF）覆于伤口表面并结合（455±5）nm的光源照射治疗。与未治疗组相比，在治疗24 h后时，PACT组伤口细菌数显著减少且有统计学意义，减少菌量约为2log10，同时证实，PCF介导的PACT还可以抑制细菌再生。
3 小 结
创伤感染模型为抗微生物药物的开发及创伤愈合过程的研究提供了一个可靠工具。随着新型光敏药物的不断合成，选择合适的动物模型验证其体内抗菌疗效并与同类光敏药物抗菌疗效进行比较将是必不可少的工作。目前国内外学者大多选择皮肤切除急性感染模型、三度烧伤感染模型，同种模型制造方法大致相似，并且大多是在小鼠背部制造一个伤口单一细菌进行感染，但也有创新，赵占娟[26]就曾在大鼠背部制造4个创口用三种细菌混合感染。因所选模型不同，所用光敏药物结构及用量、浓度不同，所感染菌株或同一菌株耐药性不同，所使用激光相应波长、能量不同，都使得目前疗效比较无法进行。控制其他影响变量对单一变量疗效进行比较，也将是学者以后研究的一大领域。
虽然目前PACT疗法在体内实验这一模块上还存在许多不足，如选择的动物体型较小、年龄偏小，褥疮溃疡模型切开皮肤对自身造成损伤较大，抗菌疗效及伤口愈合时间还达不到最完美效果，某些光敏药物暗毒性较高等，但正是由于这些不完美才提供了研究者们不断向前的动力。笔者相信通过不断改善，PACT疗法在体内实验这一部分将逐渐完善。
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（2015-01-12收稿 2016-04-13 修回）
（责任编辑 张亚丽）
Research progress on animal model and therapeutic effect of photodynamic antimicrobial chemotherapy in treatment of traumatic infection
YUAN Yao,LIU Ziquan,and DING Hui.Institute for Disaster and Emergency Rescue Medicine,Affiliated Hospital to Logistics University of Chinese People’s Armed Police Forces,Tianjin 300162,China
DING Hui,E-mail:huidingah@163.com
Due to the abuse of antibiotics,bacterial resistance has become a more and more serious problem and the treatment of wound infections are suffering more challengs,whereas photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT)is a promising novel strategy for the treatment of resistant bacteria.This paper reviews recent development of different animal models of traumatic infections,its characters and therapeutic efficacy of photosensitizers in vivo,which aims to provide evidence for optimal application of these models,and for parallel comparison of therapeutic efficacy of the same kind of photosensitizers or animal models.
photodynamic antimicrobial chemotherapy;animal models;traumatic infection;antimicrobial efficacy
R965.7
10.13919/j.issn.2095-6274.2016.04.012
天津市自然科学基金（15JCYBJC28500）
天津市卫生局科技基金（2015KZ123）；
武警后勤学院附属医院基金（FYM201418）
袁 瑶，硕士研究生在读，E-mail:825150601@qq.com
300162 天津，武警后勤学院附属医院救援医学研究所
丁 辉，E-mail：huidingah@163.com
