河南省紫荆黄萎病菌的分离和鉴定

赵 杨，米建华，李洪连，文才艺，汪 敏*

(1．河南农业大学 植物保护学院，河南 郑州 450002； 2．郑州紫荆山公园，河南 郑州 450003)

河南省紫荆黄萎病菌的分离和鉴定

赵 杨1，米建华2，李洪连1，文才艺1，汪 敏1*

(1．河南农业大学 植物保护学院，河南 郑州 450002； 2．郑州紫荆山公园，河南 郑州 450003)

为明确河南省郑州市紫荆山公园紫荆植株枯死的病因，采集具有典型黄萎病症状的紫荆植株，采用组织分离法分离出2株病原菌Vcg1和Vcg4，并进行鉴定。该病原菌在PDA培养基中菌落菌丝灰白色，分生孢子梗轮生，后期产生微菌核。PCR扩增菌株Vcg1和Vcg4 rDNA-ITS区段并测序，序列比对结果表明其与大丽轮枝菌(V.dahliaeKleb.)同源性最高。通过分生孢子悬浮液伤根接种法测定目标菌株在紫荆幼苗上的致病性，结果发现该病原菌能引起紫荆发病，维管束变褐色，严重的导致紫荆植株死亡。以上结果表明引起郑州市紫荆山公园紫荆枯死的病原菌为大丽轮枝菌。

紫荆； 黄萎病； 大丽轮枝菌； rDNA-ITS序列； 序列比对

紫荆(Cercischinensis)是原产于我国的豆科紫荆属丛生或单生灌木[1]，具有较高的观赏价值和药用价值等[2-3]。紫荆花颜色艳丽，叶片颜色随季节变化，春季黄绿色，夏季碧绿色，至秋季成明黄色，常用于城市、学校、公园、庭院的绿化[4]。紫荆的皮、根和花朵均可入药，从紫荆花中提取的天然色素既经济安全又符合现代健康标准[5]。紫荆根系发达，能够通过吸收污染土壤中的重金属元素来改善土壤环境[6]。

紫荆病害主要包括角斑病、灰霉病、黄萎病等[7-8]。黄萎病是紫荆重要病害之一，受到黄萎病菌侵染的紫荆叶片叶尖叶缘出现黄色病斑或整片叶褪绿干枯，后期叶片干枯萎蔫，严重影响其观赏价值、绿化价值和药用价值。许多国外学者研究表明，引起紫荆黄萎病的病原菌为大丽轮枝菌(V.dahliaeKleb.)和黑白轮枝菌(V.albo-atrum)[9-10]。而国内对紫荆黄萎病害的报道较少。1987年，王立新等首次从紫荆上分离出大丽轮枝菌[11]。2013年陆文静等从陕西杨凌采集紫荆病株，分离出了大丽轮枝菌，并对紫荆黄萎病病原学进行了研究[12]。

2008年开始，河南省郑州市紫荆山公园的紫荆出现叶片边缘枯黄、开花减少现象，病害逐渐蔓延扩展，到2013年严重发生，发病率高达40%，发病植株维管束变褐坏死，严重的导致植株死亡。为明确紫荆枯死的原因，拟通过常规组织分离法从发病紫荆植株上分离病原菌，通过形态学观察和分子生物学方法进行鉴定，并测定病原菌致病性，以明确其病原，为该病害的防治奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

具有典型黄萎病症状的紫荆植株，于2015年6月16日在郑州市紫荆山公园采集得到；紫荆1年生幼苗，用于病原菌的致病性测定。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离与培养 采用常规组织分离法进行病原菌的分离。将具有典型黄萎病症状的紫荆枝条截取5 cm左右，分别在70%的乙醇和5%的次氯酸钠溶液中浸泡2 min进行表面消毒，消毒后切成小片放置于PDA培养基中。长出菌落后进行纯化，并单孢分离，-70 ℃保存备用。

1.2.2 病原菌的形态特征观察 将纯化过的菌株在PDA培养基上进行培养，14 d后观察菌落的形态。挑取菌丝，在显微镜(Nikon E100)下观察菌株的菌丝、分生孢子及产孢结构的形态和大小。根据菌株的表型特征参照文献[13]对其进行种属的初步鉴定。

1.2.3 病原菌的分子生物学鉴定 病原菌活化后，将菌丝接种到PDB液体培养基中，放置于摇床上进行培养，培养条件为温度25 ℃、转速150 r/min。5 d后用4层纱布过滤，灭菌的吸水纸吸干水分收集菌丝。将菌丝加液氮充分研磨后，采用CTAB法提取真菌的总DNA[14]。利用紫外分光光度计(ND-2000)测量DNA溶液质量浓度，并稀释到10 ng/μL备用。

采用通用引物ITS1和ITS4进行PCR，扩增待测菌株的ITS序列。扩增引物序列为ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。扩增体系为25 μL，其中基因组DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，PremixTaq12 μL，ddH2O 10 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后，通过EB染色在紫外灯下成像进行检测，之后送交生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将所得序列提交到GenBank中，并利用BLAST进行序列的同源性比对，获取的同源序列采用MEGA 5.1构建系统发育树，以明确病原菌的分类地位。

1.2.4 病原菌致病性测定 首先采用谷素静等[15]的方法制备黄萎病菌分生孢子。将-70 ℃下保存的菌株活化后，转接到PDA平板上25 ℃条件下生长10 d，加入2 mL无菌水，用灭菌棉签涂擦菌落表面，将洗下的孢子悬浮液均匀涂抹于PDA培养基表面，25 ℃暗培养7 d，用无菌水洗下孢子，使用4层纱布将菌丝过滤，血球计数板测定孢子浓度，用无菌水调节孢子悬浮液浓度至1.0×107个/mL，备用。

采用伤根接种法测定所分离菌株的致病性[16]。将紫荆幼苗根部土壤小心扒开，用灭菌刀片在紫荆幼苗根部轻轻划动进行伤根。将配制好的孢子悬浮液滴到紫荆幼苗根部的伤口处，每株约50 mL。每个菌株接种4棵紫荆幼苗，并设置清水对照。接种后将紫荆置于人工气候箱中25 ℃、光照16 h、黑暗8 h条件下进行培养，观察并记录发病情况，30 d后统计。对接种后发病的植株，根据柯赫氏法则进一步进行病原菌的分离和鉴定。

2 结果与分析

2.1 紫荆黄萎病症状特征及病原菌的分离

紫荆山公园发病的紫荆植株典型症状有黄枯型和青枯型2种。黄枯型症状：植株发病初期叶片边缘变黄，逐渐扩展为坏死焦枯，严重情况下整个叶片变黄枯死；青枯型症状：植株叶片出现灰绿色干枯，叶片皱缩萎蔫干枯但不褪绿，发病后期叶片整体卷曲干脆。紫荆山公园发病的紫荆植株以黄枯型症状为主。随着病害的扩散，植株出现“半边疯”的症状，枝条整枝或植株一侧发病严重，严重者整株枯萎死亡。横切发病紫荆植株枝条，观察发现，大多数发病紫荆植株的维管束有褐色病变(图1)。

A.健康紫荆植株；B.枯死紫荆植株；C.黄枯型发病紫荆；D.青枯型发病紫荆；E.发病紫荆维管束；F.健康紫荆维管束

采用组织分离法对具有典型黄萎病症状的紫荆植株进行病原菌的分离，从2株发病紫荆植株上分离纯化出2株真菌菌株 Vcg1和Vcg4，而健康植株则未能分离出相应的菌株。

2.2 病原菌的形态学特征

将分离到的2个菌株在PDA培养基上25 ℃培养14 d后，观察其菌落形态。2个菌株生长较为缓慢，整体菌落呈规则圆形，初期菌丝灰白色，后期菌落会产生黑色微菌核，边缘整齐，菌丝致密(图2)。在显微镜下观察，菌株分生孢子梗典型轮生，每层轮枝具有3～4个分枝，分生孢子长卵圆形，单胞无色(图3)。

A.正面；B.背面

A、B比例尺分别为50、20 μm

2.3 病原菌的分子生物学鉴定结果

采用通用引物ITS1/ITS4对菌株Vcg1和Vcg4的rDNA-ITS序列进行扩增，PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到500 bp左右的条带。PCR产物测序后提交至GenBank，得到的登录号分别为KU360077和KU360078。BLAST比对分析结果显示，菌株Vcg1和Vcg4均与登录号为KM013462.1(V.dahliaeKleb.)和KC156640.1(V.dahliaeKleb.)的菌株同源性高达100%。

利用软件MEGA 5.1通过非加权组平均法(UPGMA法)构建系统进化树(图4)，可以发现，Vcg1和Vcg4与大丽轮枝菌的遗传距离最近，与从棉花(KC156637)、茄子(AB353347)、黄栌(AB370339)和紫荆(AB735536)上分离出的大丽轮枝菌聚在同一分支。

图4 Vcg1和Vcg4基于rDNA-ITS序列分析的系统发育树

通过形态学特征观察和rDNA-ITS序列分析，明确从发病紫荆植株上分离出的病原菌菌株Vcg1和Vcg4均为大丽轮枝菌。

2.4 病原菌致病性测定结果

将菌株Vcg1、Vcg4的孢子悬浮液接种到紫荆幼苗上，7 d后紫荆幼苗开始发病，叶缘有黄色病斑出现。接种30 d后，所有接种紫荆幼苗均发病，严重的植株枯死，叶片卷曲萎黄，维管束出现褐色坏死。植株发病症状和自然条件下发病现象一致，而清水对照紫荆幼苗生长状况良好，未表现任何症状(图5)。

A.Vcg1接种发病情况；B.Vcg4接种发病情况；C.清水对照

采用组织分离法对感病植株茎秆进行病原菌分离，2～3 d发病植株茎秆长出白色菌落，且菌落形态特征与从自然发病紫荆植株上分离出的病原菌形态特征相同(图6)。

A.正面；B.背面

3 结论与讨论

本研究对郑州市紫荆山公园发生黄萎病害的紫荆进行组织分离，得到2个真菌菌株。通过形态学特征观察和rDNA-ITS序列分析，将这2个菌株鉴定为大丽轮枝菌(V.dahliaeKleb.)。进一步通过柯赫氏法则进行致病性测定，证明分离到的真菌为引起紫荆黄萎病的病原菌，且致病力较强，30 d左右可导致紫荆幼苗枯死。该结果与陆文静等[12]从陕西杨凌紫荆上分离到的病原菌相同。鉴于郑州市紫荆黄萎病危害严重，有必要加强该病害的综合防治技术研究。

本研究仅从紫荆上分离到大丽轮枝菌，而国外学者认为紫荆黄萎病的病原菌包括大丽轮枝菌和黑白轮枝菌[9-10]。黑白轮枝菌在较高温度条件下不能致病(25 ℃以上)，但在较低温度条件(20～24 ℃)下可以引起寄主的黄萎病害[17]。我国气候条件复杂，紫荆分布范围广，河南省紫荆黄萎病菌是否存在黑白轮枝菌还有待于继续收集病害样本进行研究。此外，我国目前仅在陕西杨凌和河南郑州明确了紫荆黄萎病的发生与危害，有必要进一步调查取样，明确紫荆黄萎病在我国的发生、分布与危害情况。

本研究通过伤根接种法进行紫荆黄萎病菌的致病性测定，接种后7 d紫荆即开始发病，且发病迅速，30 d后植株严重发病，发病率达到100%。该方法可用来测定大丽轮枝菌对紫荆的致病性。

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Isolation and Identification ofVerticilliumdahliaeon Chinese Redbud in Henan

ZHAO Yang1,MI Jianhua2,LI Honglian1,WEN Caiyi1,WANG Min1*

(1.College of Plant Protection,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 2.Zhengzhou Chinese Redbud Mountain Park,Zhengzhou 450003,China)

The leaves of Chinese redbud in Zhengzhou Chinese Redbud Mountain Park turned yellow,and the vascular turned brown,with seriously disease plants dead.In order to determine the cause of death, Chinese redbud with theVerticilliumwilt symptom was collected and two isolates of Vcg1 and Vcg4 were isolated from infected Chinese redbud stems.The colonies of isolates on PDA showed gray white first, later formed microsclerotia,and the conidiophores were verticillate.The rDNA-ITS of Vcg1 and Vcg4 was amplified by PCR and sequenced.The sequence blast resulted in the highest sequence homology withV.dahliaeKleb..The pathogenicity of isolates was tested by dipping Chinese redbud seedlings roots in conidial suspensions.The pathogens could infect Chinese redbud,and made the vascular bundle brown,seriously causing plant wilted and dead.The results showed that the pathogen causing Chinese redbud wilt in Zhengzhou Chinese Redbud Mountain Park wasV.dahliaeKleb..

Chinese redbud;Verticilliumwilt;Verticilliumdahliae; rDNA-ITS; blast

2016-04-21

农业部公益性行业科技专项(201503109)；河南省教育厅科学技术研究重点项目(14A210025)；河南省棉花产业技术体系建设专项资金(S2013-07-G04)

赵 杨(1989-)，男，河南安阳人，在读硕士研究生，研究方向：植物病原真菌生物学。 E-mail:158338274512@163.com

*通讯作者：汪 敏(1974-)，男，河南新县人，副教授，博士，主要从事植物真菌病害研究。 E-mail:wangm05@sina.com

S436.8

A

1004-3268(2016)10-0089-04