不同药剂处理种子对番茄细菌性溃疡病菌的除害效果

王溪桥，左佳妮，尤 佳，李春雷，王军平

(甘肃出入境检验检疫局 综合技术中心，甘肃 兰州730010)

不同药剂处理种子对番茄细菌性溃疡病菌的除害效果

王溪桥，左佳妮，尤 佳，李春雷，王军平*

(甘肃出入境检验检疫局 综合技术中心，甘肃 兰州730010)

利用不同剂量的磷酸三钠、次氯酸钙、苏纳米、甲醛、高锰酸钾、盐酸和二氯异氰尿酸钠溶液对带番茄细菌性溃疡病菌的番茄种子进行不同时间的处理，旨在筛选出各药剂除菌的最适处理剂量和最宜处理时间。借助传统PCR方法检测药剂处理对人工接菌种子的除害效果，同时采用活菌培养法测定各药剂对番茄细菌性溃疡病菌的抑制作用。结果显示，各药剂最适宜的除害处理条件为：8%磷酸三钠处理30 min，1%次氯酸钙处理20 min，0.4%苏纳米处理20 min，甲醛100倍液处理20 min，pH值1.5的盐酸处理10 min，1%高锰酸钾处理30 min，二氯异氰尿酸钠700倍液处理40 min。应用纸床法进行发芽试验，检测各药剂处理对番茄种子发芽的影响，结果表明，各药剂处理对番茄种子的发芽率没有明显不利影响。综合7种药剂的特点、最适除害处理条件和对发芽率的影响，二氯异氰尿酸钠为最理想的种子除害处理药剂。

番茄细菌性溃疡病； 番茄种子； 除害处理； 发芽率

番茄细菌性溃疡病是由密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis，CMM)引起的种传维管束病害。该病自1910年在美国报道以来，在日本、印度、伊朗、中国、澳大利亚、新西兰等57个国家都有发生，罹病植株发生萎蔫、死亡造成缺株断垄，成熟期则造成果实皱缩、畸形，严重影响番茄的质量和产量。CMM主要随种子远距离传播，在田间或温室主要通过水、伤口等途径近距离扩散，已被欧洲及地中海植物保护组织(EPPO)、日本、俄罗斯、芬兰、法国、德国、中国等国家及组织列为检疫对象[1-2]。

目前，对番茄细菌性病害的防治主要采取种植抗病品种、种子处理和农业防病措施，并辅之以化学防治。对种子进行处理是防治细菌性病害最直接、有效的措施之一，国内外对此已经做了很多研究[3-11]。孔祥义等[12]用不同剂量的苏纳米处理带细菌性果斑病菌的甜瓜种子，发现300倍液对果斑病有明显的防治作用，另外发现，经甲醛100倍液浸泡过的甜瓜种子，发芽、鲜质量、根长、过氧化氢酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)含量、发病率、植株长势、嫁接后表现等各方面指标均良好。宋顺华等[13]用3%、5%和8%的盐酸处理西瓜种子以防治西瓜细菌性果腐病。对于带有番茄细菌性溃疡病菌的种子，王宝石等[14]用5%盐酸浸种5～10 h，王洁等[15]用1%的高锰酸钾浸泡15～20 min，Blood[16]用6%的乙酸和1.2%的乳酸处理，Fatami等[17]用0.6 mol/L的盐酸浸泡5 h然后浸泡在0.25%或0.50%的酸化乙酸铜中20 min，均可以完全除害。

关于带番茄细菌性溃疡病菌的番茄种子的处理前人未做系统性研究，且对种子处理剂处理条件的研究只是挑取单个时间或剂量进行，筛选得到的处理条件未必是最佳条件。为此，本研究根据实践经验选取7种常用种子处理剂，设计适宜的时间梯度和剂量梯度进行试验，以期筛选出每种药剂实现完全除害的最佳剂量和时间，以避免高剂量、长时间处理对种子造成的损害以及药剂的浪费。而且本研究挑选的药剂种类全，其除害机制有所不同，可以为以后复合种子处理剂的研究提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料及试剂

番茄种子：由酒泉东方种子有限公司赠予，经检测为健康无菌种子。

供试菌株：番茄细菌性溃疡病菌由甘肃省出入境检验检疫局综合技术中心外繁种子实验室分离保存。

种子处理药剂：磷酸三钠、次氯酸钙、高锰酸钾购自天津塘沽鹏达化工厂，二氯异氰尿酸钠购自常州市润洋化工有限公司,盐酸和甲醛购自天津市北方天医化学试剂厂，苏纳米(Tsunami 100)购自先正达公司。

营养琼脂(NA)购自北京陆桥生物技术有限责任公司；PCR及电泳相关试剂，如Loading buffer、dNTP、rTaq、RNase free ddH2O等均购自宝生物工程(大连)有限公司；新型植物基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；引物PSA-8/PSA-R (5′- TTGGTCAATTCTGTCTCCCTTC -3′和5′-TACTGAGATGTTTCACTTCCCC -3′)，由宝生物工程(大连)有限公司合成，特异性扩增片段长度为270 bp。

1.2 模拟带菌种子制备

将保存于-80 ℃的番茄细菌性溃疡病菌活化后接种到250 mL液体NA培养基中，28 ℃、180 r/min条件下培养24 h，测定菌液在600 nm下的吸光值，并进行平板菌落计数。检测菌液浓度达到1×108cfu/mL时，数取10 000粒番茄种子浸泡在菌液中，28 ℃、180 r/min培养24 h后，将种子从菌液中滤出，阴干。

1.3 种子带菌检测

取带菌种子100粒，浸泡在0.8%无菌生理盐水中，加入0.1%的吐温-20，4 ℃下静置过夜后在摇床上180 r/min振荡30 min。用纱布将种子滤除，10 000 r/min离心30 min后取沉淀，将沉淀用0.8%无菌生理盐水悬浮,1 000 r/min离心3 min,取上清，将上清液12 000 r/min离心5 min后取沉淀，用无菌生理盐水悬浮所得沉淀即为待测菌液，用于平板测定和PCR检测。

平板测定：取10 μL所得菌液，梯度稀释为10-1、10-2、10-3，均匀涂布在NA平板上，置于28 ℃培养箱中培养4～5 d。待培养平板长出菌落，用无菌水冲洗各平板，将所得溶液95 ℃水浴裂解处理后，作为模板直接进行PCR。

PCR检测：提取所剩菌液的基因组DNA，用特异性引物扩增目标片段。反应体系：10×Buffer(Mg2+plus)2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP Mixture 2 μL、PSA-8 1 μL、PSA-R 1 μL、5 U/L rTaq 0.5 μL、ddH2O 10 μL、菌液DNA 8 μL。反应程序为：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 7 min。

带菌种子经检测合格后备用。

1.4 药剂处理

根据生产中及前人研究所用的药剂处理时间及剂量，设计本试验的药剂处理剂量和时间，如表1所示。将带菌的番茄种子按表1所述进行浸泡振荡处理，处理完成后用无菌水冲洗3～4次，将清洗后的种子阴干备测。每个处理选用200粒种子，其中100粒用于细菌检测(方法同1.3)，100粒用于发芽试验(见1.5)，3次重复。同时，将带菌种子用无菌水处理作为阳性对照，健康种子用无菌水处理作为阴性对照。

表1 药剂处理剂量及时间

药剂处理剂量处理时间/min磷酸三钠8%20、30、4010%20、30、4012%20、30、40次氯酸钙1%10、20、301.5%10、20、302%10、20、30苏纳米0.4%10、20、300.6%10、20、300.8%10、20、301.2%10、20、30甲醛100倍液20、30、40150倍液20、30、40200倍液20、30、40盐酸pH值1.510、20、30pH值2.010、20、30pH值2.510、20、30高锰酸钾1%20、30、401.5%20、30、402%20、30、40二氯异氰尿酸钠400倍液30、40、50500倍液30、40、50600倍液10、20、30、40、50700倍液30、40、50

1.5 种子发芽率测定

在培养皿里放置2层发芽纸，充分吸湿，沥去多余水分，将100粒种子直接置于湿润的发芽纸上，盖好培养皿，放入人工气候箱进行发芽试验，温度25 ℃、相对湿度80%、7：00—18:00光照。在第5天时初次计数，将可疑的、损伤的、畸形的或不均衡的幼苗留到末次计数，将严重腐烂的幼苗或发霉的种子从培养皿中除去。第14天时末次计数，数取发育正常的幼苗，将发育不正常、硬实种子和死种子除去，计算种子发芽率。

2 结果与分析

2.1 模拟种子带菌检测

活化的CMM培养24 h后，测定其OD600为0.698，平板菌落计数测得活菌数为5.1×109cfu/mL，将健康的种子浸泡在此菌液中培养24 h后滤出阴干检测其带菌情况。PCR检测和平板检测结果分别如图1、2所示，270 bp的目标条带清晰可见，与阳性对照条带亮度相当，说明带菌种子制备成功，可以满足后续试验的要求。

M为DNA Marker; A、B、C分别为3个重复; CMM+为阳性对照; CMM-为阴性对照。下同

图2 模拟带菌平板检测

2.2 药剂处理后种子带菌检测

7种药剂对带CMM番茄种子的处理结果如表2所示。10%和12%磷酸三钠的所有处理PCR检测和平板检测结果均为阴性；8%磷酸三钠处理40 min后也未检测到CMM，处理20 min和30 min后PCR检测到CMM，而处理20 min后的平板检测结果为阳性，处理30 min后的平板检测结果为阴性，由此可推断出磷酸三钠的最佳处理条件为 8%磷酸三钠处理30 min 。

采用次氯酸钙处理时，1.5%和2%所有处理PCR检测和平板检测结果均为阴性；1%处理20 min和30 min后也未检出CMM，而处理10 min后PCR和平板测定均检出CMM，由此可知用次氯酸钙处理带CMM的番茄种子的最佳剂量为1%，最佳时间为20 min。

用苏纳米处理时，0.6%、0.8%和1.2%所有处理PCR和平板上均未检测到CMM；经0.4%苏纳米处理20 min和30 min后也未检出CMM，而处理10 min的带菌种子被检测出有CMM活菌的存在，所以用苏纳米处理带CMM番茄种子的最适剂量为0.4%，最适时间为20 min。

用甲醛处理带CMM的番茄种子，100倍液分别处理20 min、30 min和40 min后，均未检测出CMM活菌，而150倍液和200倍液分别处理20 min、30 min和40 min后，PCR和平板上均检测出CMM，所以甲醛处理带CMM的番茄种子时最佳剂量为稀释100倍，最佳时间为20 min。

分别用pH值为2.5、2.0和1.5的盐酸处理感染CMM的番茄种子，结果显示，用pH值为2.5、2.0的盐酸分别处理带菌种子10 min、20 min、30 min后，均检测到CMM活菌，同时经pH值为1.5的盐酸处理20 min和30 min后，PCR和平板上也均检测到CMM。而经pH值为1.5的盐酸处理10 min后未检测到CMM活菌。由此可知，盐酸的最佳除害条件为pH值1.5，处理10 min。

经1.5%和2% 高锰酸钾分别处理20 min、30 min、40 min后，PCR和平板上均未检出CMM，经1% 高锰酸钾处理30 min和40 min后也未检出CMM。而经1% 高锰酸钾处理20 min后检测出有CMM活菌的存在。所以高锰酸钾处理带CMM种子的最适剂量为1%，最适时间为30 min。

采用二氯异氰尿酸钠处理时，400、500、600倍液分别处理30 min、40 min和50 min以及600倍液处理10 min、20 min后均未检出CMM， 700倍液处理40 min和50 min后PCR和平板上也未检出CMM，而700倍液处理30 min后发现有CMM活菌的存在，所以二氯异氰尿酸钠处理带CMM番茄种子的最佳条件为稀释700倍后处理40 min。

表2 药剂对番茄种子上CMM的处理结果

药剂处理剂量菌液DNAPCR检测10min20min30min40min50min平板测定10min20min30min40min50min磷酸三钠8%++-+--10%------12%------次氯酸钙1%+--+--1.5%------2%------苏纳米0.4%+--+--0.6%------0.8%------1.2%------甲醛100倍液------150倍液++++++200倍液++++++盐酸pH值1.5-++-++pH值2.0++++++pH值2.5++++++高锰酸钾1%+--+--1.5%------2%------二氯异氰尿酸钠400倍液------500倍液------600倍液----------700倍液+--+--

注：“+”表示检出CMM，“-”表示未检出CMM。

2.3 药剂处理对番茄种子发芽率的影响

将用药剂处理后的番茄种子摆在培养皿中的纸床上进行发芽试验，结果如图3—5所示。带CMM的种子发芽率为87%，健康种子发芽率为97%，两者间有显著差异；各药剂处理的种子发芽率介于93%～97%，其中经苏纳米、盐酸、高锰酸钾处理的种子发芽率稍低，为93%～95%，但与健康种子相比均没有显著性差异，与带CMM种子相比，各药剂处理发芽率均提高，且存在显著性差异。说明各药剂处理对番茄种子的发芽率没有明显不利影响。

图3 次氯酸钙、苏纳米、盐酸处理后番茄种子的发芽率

图4 磷酸三钠、高锰酸钾、甲醛处理后番茄种子的发芽率

图5 二氯异氰尿酸钠处理后番茄种子的发芽率

3 结论与讨论

番茄细菌性溃疡病是一种典型的种传病害[18]。王宝石等[14]研究表明，CMM病菌主要附着在种子内外，因此对番茄种子进行除害是防治番茄细菌性溃疡病发生的有效方法之一。本研究选用7种药剂进行处理，以筛选不同药剂消除番茄细菌性溃疡病菌的最适处理时间和最适处理剂量。磷酸三钠在水中完全分解为磷酸氢二钠和氢氧化钠，属于碱类消毒剂，它可以使病菌细胞膜破裂，沉淀菌体蛋白[19]。用8%磷酸三钠处理带菌种子30 min，PCR检测结果为阳性但平板检测结果为阴性，由此可推断,带菌种子经过该处理已没有活菌存在，PCR检测到的应为CMM残体，所以8% 磷酸三钠处理带菌种子30 min就可以达到完全除害效果。次氯酸钙和二氯异氰尿酸钠属于含氯消毒剂，它们主要是通过氧化还原反应影响细菌酶的活性，或因化学结构与代谢物相似，竞争或非竞争性地同酶结合而抑制酶的活性，引起菌体死亡[19]，次氯酸钙除去全部CMM病菌的最适条件为1%剂量处理20 min，二氯异氰尿酸钠除害的最佳条件为700倍液处理40 min。苏纳米、盐酸和高锰酸钾属于氧化剂类消毒剂，消毒原理和含氯消毒剂相似[19]，通常用0.6%的苏纳米对种子进行除害处理，可能由于菌种差异，苏纳米对带CMM番茄种子彻底除害的条件是0.4%剂量处理20 min，另外盐酸的最佳处理条件为pH值1.5处理10 min，高锰酸钾的最佳处理条件为1%剂量处理30 min。甲醛作为一种常用醛类种子处理剂，主要依靠醛基,作用于菌体蛋白(包括酶)的醛基、羟基、羧基、氨基,使其烷基化,引起蛋白质变性、凝固,造成微生物死亡，对于带CMM的番茄种子，甲醛100倍液处理20 min就可完全除害。综上所述，虽然7种药剂均有很好的除害效果，但磷酸三钠达到除害效果需要很大剂量，从经济角度考虑略有劣势；苏纳米、盐酸和高锰酸钾氧化性很强，对工作人员的安全和健康有一定威胁；二氯异氰尿酸钠是高效、广谱、安全的消毒剂，达到除害效果所需的剂量很低，而且低毒，对种子发芽率没有不利影响。综合7种药剂的特点、最适除害条件和对发芽率的影响，二氯异氰尿酸钠为最理想的种子除害处理药剂。

发芽率是衡量种子质量的重要指标之一，很多种子处理剂会严重影响种子的发芽率和种子质量。赵秋菊等[20]发现，用8%的盐酸处理后的西瓜种子外表出现深裂纹，8%的双氧水处理后西瓜种子会出现种子爆裂的情况。虽然本研究中种子处理后未发生以上情况，但是药剂高剂量、长时间处理后，种子发芽率略有下降。如何进一步提高药剂处理后的种子发芽率，以及药剂处理对种子发芽后植株发育的影响还有待进一步研究。

[1] CABI and EPPO for the European Union．CABI and EPPO quarantine pests for Europe[M].2nd ed.Wallingford:CAB International,1997.

[2] 农业部．中华人民共和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录[Z].北京：农业部，1992.

[3] Agrawal K,Sharm D K,Jain V K.Seed-borne bacterial diseases of tomato (LycopersiconesculentumMill.) and their control measures:A review[J].International Journal of Food,Agriculture and Veterinary Sciences,2012,2 (2):173-182.

[4] 刘玉英,郭军,田时炳,等.我国蔬菜种子处理技术研究进展[J].南方农业,2008,2(6):87-91.

[5] 毛连纲,颜冬冬,吴篆芳,等.种子处理技术研究进展[J].中国蔬菜,2013(10):9-15.

[6] 张莉莉,姜丽静,于锡宏,等.蔬菜种子播种前预处理的研究进展[J].东北农业大学学报,2009,40(8):131-133.

[7] 张静,胡立勇.农作物种子处理方法研究进展[J].华中农业大学学报,2012,31(2):258-264.

[8] 赵根,沈毅,陈丽萍,等.蔬菜种子处理技术研究进展[J].农业科技通讯,2013(12):244-247.

[9] 于海霞.番茄种子前处理技术的研究[D].哈尔滨：东北农业大学,2014.

[10] 张龑,寇明明,孙小武.西瓜播种前种子处理概述[J].中国瓜菜,2007(4):29-31.

[11] 王绍军.化学方法处理种子对黄瓜生长发育的影响[J].天津农业科学,2002,8(1):34-36.

[12] 孔祥义,罗丰,肖春雷,等.不同药剂对甜瓜细菌性果斑病(BFB)带菌种子处理的影响[J].广东农业科学,2012(5):74-76.

[13] 宋顺华,吴萍,孟淑春,等.种子处理对西瓜细菌性果斑病的防治效果[J].中国瓜菜,2013,26(3):5-9.

[14] 王宝石,王成云,张玉艳.番茄细菌性溃疡病发生与防治[J].上海蔬菜,2013(4):59-60.

[15] 王洁,曹慧,张芸.蔬菜种子处理防治病害的方法[J].种子科技,2008(2):50-51.

[16] Blood H L.A possible acid seed soak for the control of bacterial canker of the tomato[J].Science,1937,86:199-200.

[17] Fatami M,Schaad N W,Bolkan H A.Seed treatment for eradicatingClavibactermechiganensissubsp.mechiganensisfrom naturally infected tomato seeds[J].Plant Diseases,1991,75(4):383-385.

[18] 田晓燕,张庆萍,王燕春,等.内蒙古地区番茄溃疡病菌PCR快速检测技术及22个番茄品种种子表面带菌检测[J].华北农学报,2015,30(1):150-153.

[19] 胡云龙.常用消毒剂分类及其特点[J].养殖技术顾问,2005(4):38-39.

[20] 赵秋菊,寇明明,罗伏青,等.种子处理对西瓜细菌性果腐病种子带菌的影响[J].中国种业,2008(12):56-57.

Harm-elimination Effects of Seed Treatment with Different Agents on Bacterial Canker of Tomato

WANG Xiqiao,ZUO Jiani,YOU Jia,LI Chunlei,WANG Junping*

(Technology Center of Gansu Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Lanzhou 730010,China)

The tomato seeds infected with bacterial canker were treated by different concentrations of trisodium phosphate,calcium hypochlorite,tsunami,formaldehyde,potassium permanganate,hydrochloric acid,and sodium dichloroisocyanurate solutions for different time,to screen out the optimum concentration and optimum processing time of each agent.The conventional PCR method was used to detect the effectiveness of harm-elimination treatment to inoculated seeds,and plate culture method was used to detect the inhibition effect of agents on the pathogen of bacterial canker.The results showed that the most appropriate treatment conditions for each agent were as follows:8% trisodium phosphate treated seeds for 30 min,1% calcium hypochlorite treated seeds for 20 min,0.4% tsunami treated seeds for 20 min,100-fold dilution of formaldehyde treated seeds for 20 min,hydrochloric acid with pH value of 1.5 treated seeds for 10 min,1% potassium permanganate treated seeds for 30 min,700-fold dilution of sodium dichloroisocyanurate treated seeds for 40 min.The germination rate of treated seeds was tested by paper bed,and the results showed that the agents had no significant influence on tomato seed germination.Integrating their own characteristics of seven agents,the optimum treatment conditions and the impact on germination rate,sodium dichloroisocyanurate is the best agent to eliminate the pathogen of tomato bacterial canker by seed treatment.

bacterial canker of tomato; tomato seeds; harm-elimination treatment; germination rate

2015-07-27

国家质检总局质检公益性行业科研专项(201310071)

王溪桥(1984-)，男，甘肃兰州人，工程师，主要从事有害微生物鉴定工作。E-mail:brooksu37@163.com

*通讯作者：王军平(1976-)，男，甘肃正宁人，高级农艺师，主要从事植物检疫工作。E-mail:wangjp465@sohu.com

S436.412.1;S351.1

A

1004-3268(2016)03-0092-06