苦荞糖基转移酶基因的克隆及活性鉴定

李茂菲，周 婧，姚攀锋，赵学荣，李成磊，吴 琦

(四川农业大学 生命科学学院，四川雅安 625014)



苦荞糖基转移酶基因的克隆及活性鉴定

李茂菲，周 婧，姚攀锋，赵学荣，李成磊，吴 琦*

(四川农业大学 生命科学学院，四川雅安 625014)

糖基化修饰在调控各种小分子的溶解度、稳定性及生物活性中具有重要的作用。该研究基于苦荞转录组数据，克隆获得2条糖基转移酶基因(FtUFGT4和FtUFGT5)，并对其在大肠杆菌中的表达产物进行酶催活性鉴定。结果表明：(1)获得的苦荞糖基转移酶基因cDNA分别为1 434和1 470 bp，其编码蛋白同属于拟南芥糖基转移酶E类群，可能参与黄酮类化合物的糖基化。(2)多重序列比对表明，FtUFGT4和FtUFGT5蛋白C端都具有PSPG框，其催化活性位点分别是H17和H16；FtUFGT4和FtUFGT5都是典型的植物糖基转移酶GT-B结构，二者的蛋白模型能与矢车菊素和UDP进行分子对接。(3)FtUFGT4和FtUFGT5在大肠杆菌中获得了可溶性表达，薄层层析实验表明二者均具有催化矢车菊素糖基化为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的活性。

苦荞；UDP-糖基转移酶；基因克隆；活性鉴定

植物次生代谢产物的结构多样性是由于植物在长期进化过程中对生态环境产生化学适应的结果，具有防御病原微生物，吸引传粉、固氮和防紫外线等多种功能[1]。植物次生代谢产物种类繁多，结构迥异，包括酚类化合物、萜类化合物和含氮有机碱等在内的小分子化合物动态地调节了植物细胞内的平衡。为应对外界环境的复杂变化，植物体内经常发生小分子修饰作用赋予了其更大的灵活，从而形成了植物次生代谢产物的多样性。糖基化是植物体内重要的调节机制之一，由糖基转移酶 (glycosyltransferase, GTs) 催化的糖基化修饰在调控各种小分子的溶解度、稳定性及生物活性中扮演了非常重要的角色。目前，据序列的相似度进行分类的碳水化合物活性酶数据库 (CAZy, http://www.cazy.org/GlycosylTransferases.html) 中，共储存了243 230条糖基转移酶的序列，所有的序列被归到了98个家族中。其中，尿嘧啶核苷二磷酸糖基转移酶 (UDP glycosyltransferases, UGTs) 主要存在于GT1家族中，负责将活性糖基从糖基供体转移到一些次生代谢产物 (如激素、黄酮醇、花青素) 上以增加其稳定性，这些糖基供体可以是UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖醛酸等[2]。

花青素是植物中最大的水溶性天然色素，经苯丙烷类代谢途径合成，具有抗氧化、抗突变、预防心脑血管疾病、保护肝脏和抑制肿瘤细胞发生等多种功能[3]。花青素在结构上主要分3类：天竺葵素、矢车菊素和飞燕草素。植物中游离的花青素极不稳定，多以糖基化形式存在。由UGTs催化的糖基化反应最常发生在花青素的C-3、C-5、C-7、C-3’ 和C-4’位置，其中最多的是由花青素3-O糖基转移酶催化的C-3位置的羟基取代反应[4]。花青素3-O糖基转移酶最先在玉米中[5]被发现，之后相继在石竹、牵牛花、紫罗兰等植物中都被分离到。大量研究表明，花青素3-O糖基转移酶的活性减小会导致植物中的花色苷含量的积累也明显减少[6]。

苦荞 (Fagopyrumtataricum)又称鞑靼荞麦，是一种富含黄酮的药食两用小杂粮[7]。研究表明，苦荞可以通过增加花青素的合成来抵御紫外、冷[8]和干旱等非生物学胁迫，且芽期苦荞中花青素主要以矢车菊素3-O-葡萄糖和矢车菊素3-O-芸香糖苷的形式存在，游离状态的矢车菊素极少见[9]。本研究在前期获得3条花青素3-O-糖基转移酶基因的基础上[10]，又克隆得到了2条花青素3-O-糖基转移酶基因FtUFGT4和FtUFGT5，并对其编码蛋白进行分子生物学分析，进一步采用原核表达技术，在体外初步验证了二者对矢车菊素3-O糖基化的酶催活性。

1 材料和方法

1.1 材 料

苦荞 (‘西荞2号’) 种植于四川省雅安市四川农业大学实验基地。大肠杆菌DH5α、原核表达载体pEGX4T-1质粒和大肠杆菌BL21(DE3)由本实验室保存，其他化学药品为进口或国产分析纯试剂。

1.2 方 法

1.2.1 基因克隆 采用植物RNAout试剂盒[天根生化科技 (北京) 有限公司]提取苦荞花期总RNA。以提取的RNA为模板，多聚胸腺嘧啶(Oligo-d T)为引物，通过Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒(Fermentas 公司)制备cDNA 第一链。根据苦荞花期转录组数据设计引物(表1)。以花期苦荞cDNA为模板，进行PCR反应。PCR反应体系总体积为25 μL，含cDNA模板1 μL、引物1 μL、高保真DNA聚合酶(Prime STAR HS Polymerase，TaKaRa)12.5 μL和无菌去离子水9.5 μL。反应条件：98 ℃预变性4 min； 98 ℃预变性 1 min，58 ℃变性 1 min，72 ℃延伸 1 min 30 s，30个循环； 72 ℃ 延伸10 min。按照DNA A-Tailing Kit试剂盒说明书对回收产物进行加A后进行T-Vector pMDTM19(Simple)载体克隆(TaKaRa)，筛选阳性转化子测序。

1.2.2 生物信息学分析 利用DNAman 8.0对获得FtUFGT基因编码蛋白进行理化性质预测和多重序列比对。从NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下载其他植物糖基转移酶序列，采用MEGA 4.0软件，根据最大简约法构建FtUFGT的进化树。矢车菊素的三维结构文件从chEBI (http://www.ebi.ac.uk/chebi/init.do)下载，登录号为CHEBI:71682，UDP的三维结构文件从RCSB PDB(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)上下载的黄酮3-O糖苷转移酶(PDB：2C9Z)的三维结构文件中获得。利用蛋白质建模软件SWISS-Model建立蛋白质模型，并用Discovery Studio2.5的刚性对接程序LibDock将FtUFGT蛋白质模型与矢车菊素配体和UDP进行分子对接，对接范围的球形半径设置为9 Å，其余为默认参数。对接结果用Pymol软件做图像调整。

表1 基因克隆及表达载体引物序列

1.2.3FtUFGT基因的原核表达和蛋白纯化 以含有FtUFGT基因的T载体质粒为模板，以加酶切位点引物(表1)进行PCR反应，并将扩增产物克隆到T-Vector pMDTM19(Simple)载体，进一步克隆到原核表达载体pGEX 4T-1。将阳性重组表达载体质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) ，挑选单菌落接种到10 mL液体LB培养基中 (含氨苄青霉素500 μg/mL)，37 ℃培养过夜。按2%接种量接种于50 mL液体LB培养基中 (含氨苄青霉素500 μg/mL)，37℃培养至OD600=0.6～0.8，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG) 至终浓度为0.1 mmol/L，20 ℃诱导8 h。收集菌液，重悬于pH 7.4的磷酸缓冲液经超声波处理后，收获上清，并按照蛋白纯化试剂盒GST-SefinoseTMKit(生工生物工程上海有限公司)的操作步骤纯化蛋白。同时，将菌液、沉淀、上清和蛋白纯化产物，经SDS-PAGE电泳分析。

1.2.4 糖基转移酶催化活性鉴定 采用薄层层析技术 (TLC) 对酶的活性进行初步的定性鉴定。参照FORD C M[11]的方法，反应体系中含9 mmol/L UDP-葡萄糖，14 mmol/L β-巯基乙醇，100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，100 μmol/L的矢车菊素，约5 μg纯化蛋白，于30 ℃反应30 min后，用等体积的乙酸乙酯萃取，采用薄层层析法进行定性分析。依照薄层色谱法(中国药典[12])试验，以1 μL矢车菊素 (2 mg/mL)、2 μL矢车菊3-O葡萄糖苷 (1 mg/mL)和两者的混合物作为对照，将反应后的萃取物分别点样于羧甲基纤维素钠硅胶 G 薄层板上，以正丁醇∶乙酸∶水=2∶1∶2为展层剂，展开，取出，晾干，碘蒸气显色。计算斑点的Rf值，鉴别反应液中新增物质的成分。

2 结果与分析

2.1 糖基转移酶催化活性鉴定

以花期苦荞总RNA反转录成的cDNA为模板，2对引物PCR扩增后均获得了1条约1 500 bp的特异条带(图1)。测序结果表明，获得的扩增产物分别为 1 434和 1 470 bp，与转录组数据完全一致，命名为FtUFGT4和FtUFGT5。序列分析表明，苦荞FtUFGT4 cDNA 序列包含一个1 434 bp ORF，编码477个氨基酸，预测的分子量大小为53.4 kD，等电点为5.15；苦荞FtUFGT5 cDNA 序列包含一个1 470 bp ORF，编码489个氨基酸，预测的分子量大小为54.7 kD，等电点为4.94。

2.2 FtUFGT4和FtUFGT5编码蛋白进化树的构建

利用Mega4.0软件构建基于植物UGT氨基酸序列的系统进化树(图2)。结果表明，LIM E K[13]据PSPG保守框从拟南芥中鉴定出107条序列，根据序列之间的进化关系把所有序列分为14个族(A～N)。据此分类法，苦荞花青素3-O糖苷转移酶FtUFGT1～3属于F族，而FtUFGT4和FtUFGT5同属于E族，此家族中还包括At71和72家族，其中At71C1与FtUFGT4相似度是35.56%，和FtUFGT5相似度是41.12%。

2.3 FtUFGT4和FtUFGT5多重序列比对

选取已解析出蛋白质三维结构且有花青素-3-O葡萄糖苷转移酶活性的VvGT、Mt78G1、Mt85H2和Ct78k6，与FtUFGT4和FtUFGT5氨基酸序列进行多重序列比对(图 3)。结果显示，它们的蛋白C端序列相对于N端更保守，C端和N端的连接区氨基酸的保守度较低。在VvGT1的H20、Mt78G1的H26和Ct78K6的H17，与 FtUFGT4的H17和FtUFGT5的H16是高度保守的。在糖苷转移酶C端都有一个44氨基酸的PSPG(the plant secondary product glycosyltransferase)保守区域，此区域是糖基转移酶的识别基序。PSPG框的第一位氨基酸和最后一位氨基酸都是非常保守的，在FtUGT4中分别是W341和Q384，在FtUFGT5中是W357和Q400。

M. DNA Marker Ⅲ；1. FtUFGT4； 2. FtUFGT5图1 苦荞FtUFGT4和FtUFGT5基因PCR扩增Fig.1 PCR amplification of FtUFGT4 and FtUFGT5 form tartary buckwheat

At. 拟南芥；Vv. 葡萄；Mt. 蒺藜苜蓿；Zm. 玉米；Cr. 长春花；Ac. 洋葱；St. 马铃薯； Bp. 雏菊；Cm. 柚子；Bn. 欧洲油菜； Sr. 甜菊；Sb. 高粱图2 苦荞FtUFGT4和FtUFGT5蛋白的系统进化树At.Arabidopsis thaliana；Vv.Vitis vinifera；Mt.Medicago trunkatula；Zm. Zea mays；Cr.Catharenthus roseus；Ac.Allium cepa；St.Solanum tuberosum；Bp.Bellis perennis；Cm.Citrus maxima；Bn.Brassica napus；Sr.Stevia rebaudiana; Sb. Sorghum bicolorFig.2 Phylogenetic relationships for tartary buckwheat FtUFGT4, FtUFGT5 and UFGTs in other plants

2.4 FtUFGT4和FtUFGT5蛋白模型及分子对接

利用蛋白质建模软件Swiss-Model，以三萜烯糖苷转移酶UGT71G1 (PDB:2ACV)为模板建立FtUFGT4和FtUFGT5的蛋白模型，并将蛋白质模型与矢车菊素和UDP进行分子对接(图4)。由图4，A可知，FtUFGT4的N端由位于中间的6个扭曲平行β片层及围绕它的8个α螺旋组成，C末端由扭曲平行的6个β片层和两侧的10个α螺旋组成。由图4，B可知，FtUFGT5的N端由位于中间的7个扭曲平行β片层及围绕它的8个α螺旋组成，C末端由扭曲平行的5个β片层和两侧的9个α螺旋组成。C端和N端是通过一个柔性环连接，在C端和N端之间形成一个松散可变的深沟。如图4， C、D 所示。在FtUFGT4中C285、S288、A342、N363和E367与UDP分子形成氢键，G16、W362和E383与矢车菊分子形成氢键，Q384、H17、D126、W341和F128等氨基酸残基形成疏水口袋，为矢车菊素和UDP的酶促反应提供适合的环境。在FtUFGT5中，G15、A358、A378和A379与UDP形成氢键，Q400、H16、F129、F153、F196、F206和W357等氨基酸残基形成疏水口袋。分子对接结果显示FtUFGT4和FtUFGT5可能以矢车菊素和UDP-葡萄糖为底物进行酶促反应。

2.5 FtUFGT4和FtUFGT5基因在大肠杆菌中的表达

将含有pEGX 4T-1-FtUFGT4和pEGX 4T-1-FtUFGT5重组质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)诱导表达后的全细胞裂解液、裂解液上清和裂解液沉淀及其亲和层析纯化的酶蛋白进行SDS-PAGE分析。结果(图5)表明， FtUFGT4和FtUFGT5的基因工程菌经IPTG诱导后，大肠杆菌产生了一条80 kD条带，在细胞破碎物的上清和沉淀中均有存在。由于GST蛋白约25 kD，目的蛋白的分子量实际约有55 kD，符合理论预期。由图5可以看出，表达蛋白经GST-SefinoseTMKit纯化后，获得了条带单一的FtUFGT4和FtUFGT5融合表达酶蛋白，可进一步用于酶催活性鉴定。

2.6 苦荞FtUFGT4和FtUFGT5酶催活性鉴定

采用薄层层析法对FtUFGT4和FtUFGT5反应产物进行鉴定。FtUFGT4和FtUFGT5的酶促反应液都在接近矢车菊素3-O葡萄糖苷的位置有斑点。分析(图6)表明，矢车菊素的Rf值0.67，矢车菊素3-O葡萄糖苷的Rf值0.46，FtUFGT4和FtUFGT5酶促反应液的Rf值分别是0.42和0.47。FtUFGT4和FtUFGT5的Rf值均与矢车菊素3-O葡萄糖苷的Rf值接近，证明FtUFGT4和FtUFGT5反应液中存在矢车菊素3-O葡萄糖苷，FtUFGT4和FtUFGT5能以UDP-葡萄糖和矢车菊素为底物，生成矢车菊素3-O葡萄糖苷。

Vv.葡萄；Mt.蒺藜苜蓿；Ct.蝶豆. 黑色框标出催化活性位点H和PSPG图3 苦荞FtUFGT4和FtUFGT5蛋白的多重序列比对Vv. Vitis vinifera; Mt. Medicago truncatula; Ct. Clitoria ternatea. The catalytic base of H and PSPG Box are boxed in blackFig.3 Amino acid sequence alignment of tartary buckwheat FtUFGT4 and FtUFGT5 with UFGTs in other plants

A和B. FtUFGT4和FtUFGT5的三维结构带状图；PSPG框用红色显示。C和D. FtUFGT4和FtUFGT5结合区域的局部图。矢车菊素分子(靛蓝)和UDP(蓝色)用棍状模型显示，参与UDP和矢车菊素结合的氨基酸用红色线状结构表示并加标签。绿色虚线表示氢键图4 苦荞FtUFGT4和FtUFGT5的同源建模及分子对接图A，B. Ribbon diagram of the crystal structure of FtUFGT4 and FtUFGT5; PSPG box is shown in red；C，D. Close-up view of the donor-binding site in FtUFGT4 and FtUFGT5；The cyanidin molecule (cyan) and a UDP moiety (blue) are shown as stick models. Residues involved in the UDP and cyanidin-binding are shown as red lines and labeled；Hydrogen bonds are depicted with grean dotted linesFig.4 The homology modeling and molecular docking of FtUFGT4 and FtUFGT5

M.蛋白质分子量标准Ⅲ；1～4为诱导后FtUFGT4的全细胞裂解液、裂解液上清、裂解液沉淀和亲和层析后蛋白；5～8为诱导后FtUFGT5全细胞裂解液、裂解液上清、裂解液沉淀和亲和层析后蛋白图5 FtUFGT4和FtUFGT5在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE分析M. Standard molecular Ⅲ；1-4. Whole cell lysate of FtUFGT4 induced, its lysate supernatant, its lysate precipitation and the protein purified by affinity chromatography, respectively；5-8. Whole cell lysate of FtUFGT5 induced, its lysate supernatant, its lysate precipitation and the protein purified by affinity chromatography, respectively.Fig.5 SDS-PAGE analysis of FtUFGT4 and FtUFGT5 expressed in E. coli

1.矢车菊素；2.矢车菊3-O葡萄糖苷；3.矢车菊素+矢车菊3-O葡萄糖苷；A，4. FtUFGT4的反应液；B，4. FtUFGT5的反应液。箭头所指为酶促反应产物图6 苦荞FtUFGT4和FtUFGT5催化反应产物的薄层层析1.Cyaniding; 2.Cyanidin 3-O-glucoside; 3.Cyaindin + cyanidin 3-O-glucoside; A，4. Reaction product of FtUFGT4; B，4. Reaction product of FtUFGT5. Arrows show the production location of enzymatic reactionFig.6 Activity identification for tartary buckwheat FtUFGT4 and FtUFGT5with thin layer chromatography

3 讨 论

糖基化修饰自然界中最重要的生理生化反应之一，也是理解植物次生代谢的前沿领域。最近研究显示，每个有机体中有接近1%的基因产物参与糖基化[14]。构建的系统进化树结果显示，FtUFGT4和FtUFGT5都被分到E族，且E族是植物的糖基转移酶中最大的家族，拟南芥的此家族可以催化包括萜类、黄酮类、脱落酸在内的化合物[15]。

一般来说GTs有严格的底物专一性和区域选择性，这主要由一些短的基序和一系列的氨基酸决定[14]。多重比对结果显示，GTs的蛋白C端氨基酸相对于N端更保守，C端和N端的连接区的保守度较低。GTs的C端是识别和结合糖基供体区，N端是识别和结合糖基受体区[16]。Mt71G1[17]的H22，Mt78G1[18]的H26，VvGT[19]的H20，Ct78K6[20]的H17等都是催化活性位点，是受体去质子化必不可少的氨基酸。本研究中，H17 和H16可能分别就是FtUFGT4和FtUFGT5的催化活性位点。PSPG框中的44个氨基酸中有10个高度保守的氨基酸有可能与UDP-葡萄糖的结合有联系[21]，FtUFGT4的PSPG框中第一个和最末氨基酸分别是W341和Q384，FtUFGT5的则为W357和Q400。PSPG框第一个氨基酸W的改变会影响植物UGTs与UDP-糖的结合，Mt85H2中的W360的吲哚环可以稳定UDP-糖的嘧啶环[22]。PSPG框中的最后一个残基若是H则更易结合半乳糖，若是Q则更利于结合葡萄糖糖苷[23]。因此，FtUFGT4和FtUFGT5可能更倾向于转移UDP-葡萄糖。

糖基转移酶在功能和序列的变化复杂，但在化学反应机制和三维结构上并没有很大的变化，所以用蛋白质的建模是一种有效的分析方式[24]。同源建模结果显示FtUFGT4和FtUFGT5是典型的GT-B构象。此外，分子对接结果证实FtUFGT4的H17、W341和Q384，以及和FtUFGT5H16、W357和Q400可参与形成疏水口袋，对蛋白质与UDP和矢车菊素的结合有重要作用。同时，Zhu等[25]在研究细菌的黏附和致病机理时发现在糖苷转移酶表面暴露的F111可能提供潜在的连接位置。FtUFGT4的F128和FtUFGT5的F129可能就是为矢车菊素的结合提供潜在位点的氨基酸。从生物信息学分析结果推测，FtUFGT4和FtUFGT5很有可能参与矢车菊素的糖基化，这也得到了进一步活性鉴定的证实。

植物的花青素糖苷转移酶不仅对花青素糖苷合成具有直接催化作用，而且在植物逆境应答分子机制方面也发挥重要作用。在对荔枝[26]和小苍兰[27]等的研究中都已证明矢车菊素的积累与矢车菊素糖基转移酶的活性成明显的正相关。在紫外和缺肥的处理下苜蓿中花青素-3-O糖苷转移酶基因UGT78G1的表达量上升，还可以与ANS基因协同表达，显著提高花色苷的含量[28]。Zhou等[10]对冷胁迫处理后的苦荞研究证明，花青素的增加伴随着FtUFGT1-3基因的上调表达。可见，本实验获得的FtUFGT4和FtUFGT5均具有催化矢车菊素形成矢车菊素3-O-葡萄糖苷的活性，可能也参与了苦荞花青素积累和抗逆应答，有待进一步深入研究。

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(编辑:宋亚珍)

Molecular Cloning and Expression of Glycosyltransferases Gene fromFagopyrumtataricum

LI Maofei, ZHOU Jing, YAO Panfeng, ZHAO Xuerong, LI Chenglei, WU Qi*

(College of Life Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an, Sichuan 625014, China)

Glycosylation modification plays an important role in the regulation of solubility, stability and biological activity of various small molecules. Based on transcriptome data, we cloned two glycosyltransferase genes from tartary buckwheat and expressed them inE.coli. The result showed that: (1) the cDNA sequences ofFtUFGT4 andFtUFGT5 were 1 434 bp and 1 470 bp in length, respectively. Both of their coding proteins were classifieds E group of AtUFGTs fromArabidopsisthaliana, which may be involved in flavonoid glycosylation. (2) Multiple sequence alignment indicated that there was a PSPG Box at their C-terminal, and the catalytic activity site was H16 and H17, respectively. Meanwhile, both of them had a typical GT-B structures in plant glycosyltransferase. Moreover, the molecular docking results exhibited that FtUFGT4 and FtUFGT5 could dock with cyanidin and UDP. (3) FtUFGT4 and FtUFGT5 were ectopic expressed in theE.colisolubly. The thin layer chromatography (TLC) proved that they showed the cyanidin 3-O-glucoside activity.

tartary buckwheat；UDP-glucosyltransferase； gene cloning；activity identification

1000-4025(2016)12-2391-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2391

2016-07-28;修改稿收到日期:2016-10-31

国家自然科学基金(31500289)

李茂菲(1992-)，女，在读硕士研究生，主要从事植物分子生物学研究。E-mail:1242009272@qq.com

*通信作者:吴 琦，博士，教授，主要从事植物分子生物学研究。E-mail: wuqi@sicau.edu.cn

Q785；Q786

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