SlCBL1基因在番茄抗灰霉病中的作用

王媛花，颜志明，解振强，冯英娜，蔡善亚

(1 江苏农林职业技术学院，江苏镇江 212400；2 江苏现代园艺工程技术中心，江苏镇江 212400)



SlCBL1基因在番茄抗灰霉病中的作用

王媛花1,2，颜志明1,2，解振强1,2，冯英娜1,2，蔡善亚1,2

(1 江苏农林职业技术学院，江苏镇江 212400；2 江苏现代园艺工程技术中心，江苏镇江 212400)

以番茄(SolanumlycopersicumL.)品种‘Micro Tom’为试材，分析番茄叶片和果实的灰霉病发病规律，及番茄类钙调磷酸酶B基因(tomato calcineurin B-like gene，SlCBL1)在叶片和果实中的表达变化；比较转SlCBL1基因番茄与对照的叶片和果实的灰霉病发病过程，分析转基因番茄抗病相关转录因子表达变化。结果表明：(1)非转基因番茄中，不同叶龄的叶片均在接种灰霉病4 d开始发病；不同发育阶段的果实接种灰霉病后发病时间也不同，其中绿果(花后16～18 d)接种5 d还未发病，白果(花后34～36 d)接种11 d开始发病，红果(花后40～42 d)接种5 d开始发病；SlCBL1基因表达量在番茄叶片中较低，在绿果期和白果期的果实中表达量最高，红果期果实中表达量最低。(2)转SlCBL1基因后，SlCBL1基因的过量表达能够抑制番茄叶片和果实灰霉病发生；同时番茄叶片和果实中几乎所有的抗病转录因子的表达量都上调，其中WRKY转录因子家族基因SlWRKY33和SlWRKY70受到强烈调控。研究说明，SlCBL1基因过量表达能够提高番茄的抗灰霉能力，其主要机理是通过影响抗病相关转录因子进而调控番茄抗灰霉病的能力。

番茄；SlCBL1；抗灰霉病

类钙调磷酸酶B基因(calcineurin B-like gene，CBL)家族是一类钙感应器。CBL基因最初在拟南芥中克隆出来，同酵母中钙调磷酸酶B和动物中的神经钙调传感器非常相似，因此被命名为类钙调磷酸酶B[1-3]。CBL1基因是CBL基因家族中研究最多的基因[4-6]。目前对CBL1基因的研究多集中于非生物胁迫，包括盐、低温、ABA和干旱等作用。近年来，多个物种中的CBL1 基因已被成功分离并进行了功能验证[7-12]。研究发现CBL1基因在不同逆境胁迫与生长发育过程中呈现不同表达模式，是植物逆境信号传导途径中的关键调控节点[13-15]。病害作为一种逆境，而关于CBL1基因在病害中的调控作用研究极少，尤其是对园艺作物中多发的灰霉病几乎没有相关研究。因此CBL1基因在植物抗灰霉病中是否也有作用，是未来研究CBL1基因功能的一个新方向。

番茄(SolanumlycopersicumL.)是一种重要的园艺作物，灰霉病是设施栽培番茄的主要病害之一，如果发生灰霉病会导致番茄减产30%～40%，造成严重损失[16]。目前番茄的灰霉病发生机理以及抗病机制研究已经取得了一些相关成果[17-22]，但还未见关于CBL1基因在番茄抗灰霉病中的作用报道。 ‘Micro Tom’是一种番茄矮化突变体。它保留了普通番茄作为模式植物的基本特征，植株矮小、生命周期更短，具有节省研究空间、缩短研究时间的巨大优势[23]，更易于在实验室可控环境条件下进行灰霉病接种处理，可以大量取样进行试验。本研究分析了SlCBL1基因在番茄中过量叶片和果实发病规律，并且进行相关抗病转录因子的表达量分析，探究SlCBL1基因在番茄抗灰霉病中的特殊作用，对深入理解番茄抗病机理有重要意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验于2014年5月～2016年3月在江苏农林职业技术学院进行。番茄品种‘Micro Tom’普通种子购买自美国Ball Horticultural Company，‘Micro Tom’转基因番茄种子由本实验室获得。试验用的灰霉菌(Botrytiscinerea)由本校生物工程中心从田间分离所得。病菌培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。灰霉菌以常规方法纯化后，接种到PDA培养基上，25 ℃恒温箱中培养14 d。叶片和果实采用不同接种方法。叶片接种时，用直径3 mm打孔器在培养基上打孔，打孔出来的菌饼置于叶片伤口处。果实处理时，在超净工作台上将培养基切下放入装有无菌水的锥形瓶中，振荡10 h后用4层纱布过滤，显微镜镜检调整，制备孢子悬浮浓度为1×105cfu/mL悬浮液，用于接种果实[24-25]。

1.2 主要培养基配方

番茄种子培养基(1/2MS培养基)：1/2MS +20 g/L蔗糖+5.5 g/L琼脂；番茄共培养培养基(MS1)：MS+20 g/L蔗糖+ 5.5 g/L琼脂 +2.0 mg/L ZT +0.5 mg/L IAA；番茄筛选培养基(MS2)：MS+20 g/L蔗糖+5.5 g/L琼脂 +2.0 mg/L ZT +0.5 mg/L IAA，高压灭菌，冷却至60 ℃加入75 mg/L卡那霉素、400 mg/L羧苄青霉素，分装培养瓶备用；番茄生根筛选培养基(MS3)：1/2MS+20 g/L蔗糖+5.5 g/L琼脂，高压灭菌，冷却至60 ℃加入50 mg/L卡那霉素和350 mg/L羧苄青霉素，分装培养瓶备用。所有培养基pH 5.8。

1.3 试验方法

1.3.1 离体番茄叶片和果实的发病规律观察 叶片：取30、50、70 d叶龄的番茄叶片，在叶片中间用消毒的接种针轻轻扎孔，用打孔器在灰霉病培养平板上去菌饼放置于叶片伤口处。将叶片放置于培养皿中，培养皿底部放置4～5张滤纸，用无菌水打湿滤纸，保证叶片在培养皿中不失水。果实：按照果实不同发育阶段取绿果(花后16～18 d)、白果(花后34～36 d)、红果(花后40～42 d)等3个发育时期的果实进行处理。在果实上面用消毒的接种针扎2个小孔，配制好的灰霉病悬浮液用毛笔均匀地涂抹在果实表面，将果实放置于湿度合适的培养皿中(培养皿条件与叶片相同)。

所有处理的叶片和果实均放在25 ℃恒温光照培养箱中进行，光周期16 h/8 h。试验重复3次，每次分别处理15个叶片和果实。从处理开始每天拍照，直到完全发病。

1.3.2 番茄叶片和果实中的SlCBL1基因表达量的检测 分别提取不同叶龄叶片和不同发育时期果实的RNA，反转录为cDNA。根据NCBI数据库中的番茄SlCBL1基因序列(GenBank登录号NM_001252118.1)，设计目的基因SlCBL1荧光定量引物(表1)，并且在NCBI中比对验证，确认引物后采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法，检测SlCBL1基因相对表达量。qRT-PCR用ABI公司的荧光定量Step oneplus仪操作，SlCBL1基因和内标Actin基因总反应体系为10 μL，包括3.5 μL super Mix，2 μL Primer Mix (10 μmol/L each)，1 μL cDNA，3.5 μL无核酸污染的ddH2O。反应程序：94 ℃预变性3 min； 94 ℃变性10 s， 55 ℃退火 30 s，40个循环后程序结束，用ABI的Stepone2.3软件分析SlCBL1基因相对表达量。

1.3.3 目的基因克隆及番茄稳定转化与转基因植株鉴定 (1)目的基因克隆 根据NCBI数据库中的番茄SlCBL1基因序列，用DNAMAN软件设计目的基因SlCBL1全长引物(表1)，PCR扩增获得SlCBL1基因全长序列。将SlCBL1基因正向构建于gateway系列表达载体pK7WG2D上，构建得到载体pK7WG2D-SlCBL1(以下简称p-SlCBL1载体)。构建好的载体转化农杆菌EHA105，穿刺保存于4 ℃冰箱，用于后续番茄的稳定转化。

(2)稳定转化 将含质粒pK7WG2D(空载)和p-SlCBL1的农杆菌EHA105在LB培养基上(含50 mg/L SPR和50 mg/L Rif)划板，28 ℃培养2 d，挑取平板上长得好的单菌落，接种到50 mL液体LB培养基中，28 ℃、2 200 r/min 在摇床中振荡培养至OD600为0.4，常温下，5 000转离心8 min，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，尽量将上清液去除后用MS液体培养基悬浮沉淀菌体，振荡培养活化菌液，至菌液OD600为0.2～0.3后备用。

挑选生长饱满的种子在超净工作台用70%乙醇冲洗30 s，无菌水冲洗2次，10%次氯酸钠消毒8 min，无菌水冲洗3次，接种于1/2MS培养基中，培养番茄无菌苗，15 d以后，选取幼嫩平展的子叶用于基因转化。沿叶脉将叶片剪成大约3 mm2叶块。将活化好的菌液倒入剪好的叶片中，轻微摇匀，浸染30 min。倒出菌液，叶片放置于无菌滤纸上吸干表面的菌液。侵染后的叶片接种于番茄共培养基MS1中，24 ℃培养箱中黑暗共培养3 d。完成共培养的番茄叶片，接种番茄筛选培养基MS2上，使伤口与培养基充分接触，在培养室中(25±2)℃、光照培养。大约40 d左右，可分化出抗性芽，将抗性芽转入番茄生根筛选培养基MS3上生根。获得完整的抗性苗。

(3)转基因植株鉴定 载体pK7WG2D和 p-SlCBL1上均携带超强表达的绿色荧光蛋白基因(eGFP)，番茄叶片切口部位长愈伤组织时，将培养瓶放在体式荧光显微镜下，抗性植株愈伤组织有明显的绿色光发出。愈伤组织分化出芽以后抗性植株的芽在荧光显微镜下发绿光，而非抗性植株发红光，可以直接将抗性植株筛选出来。将抗性植株移栽后可用体视荧光显微镜再次分别检测番茄的不同组织器官的荧光。荧光检测的同时，用PCR法检测CaM-35S启动子序列，并且用qRT-PCR方法检测目的基因SlCBL1表达量。通过以上3种方法检测，确认基因转化成功。

表1 番茄抗病相关转录因子和引物序列

1.3.4 转SlCBL1基因番茄的灰霉病抗性分析 经检测转基因番茄，开花结果之后收取T1代转基因种子。种子经低温春化后，将空载对照、转SlCBL1基因的种子播种于直径18 cm育苗盆中，基质按照泥炭土和蛭石1∶1比例混匀使用。番茄培养在白天温度25～28 ℃、夜间15～18 ℃温室中。

(1)转基因番茄叶片和果实灰霉病发生规律观察 观察转基因植株和对照植株的离体叶片和果实分别接种灰霉病发病过程，从接种灰霉病到完全发病，每天拍照记录，观察转SlCBL1基因番茄和对照的发病时间差异。

(2)转基因番茄与抗病相关基因的表达量变化分析 用qRT-PCR方法检测转SlCBL1基因番茄与空载对照相比较，果实发育不同阶段的抗病相关转录因子的表达量变化。选取与番茄抗灰霉病相关的转录因子3类，共7个。分别是番茄WRKY转录因子家族的SlWRKY1、SlWRKY33和SlWRKY70[26-28]；ERF转录因子家族的SlERF1和SlERF5[29-30]；NAC转录因子家族的SlNAC1 和SlNAC4[31-32]。基因名称、 NCBI登录号以及qRT-PCR引物见表1。

1.4 数据统计分析方法

所有基因表达量采用2-ΔΔCt法来计算相对表达量。转基因番茄的7个抗病转录因子的表达量均以空载对照植株的相应基因表达量为对照。

2 结果与分析

2.1 离体番茄叶片和果实的发病规律分析

对番茄离体叶片和果实的发病规律分析发现，叶片和果实发病规律有差异。不同叶龄叶片，接种灰霉病后开始发病时间都在接种后第4天，发病后第5天开始病症慢慢严重，直至叶片死亡(图1)。果实不同发育阶段的发病规律有很大差异(图2)。红果接种后第5天开始发病，一旦发病后，病菌很快蔓延到全部果实，果实开始腐烂变质；白果接种后第11天才开始发病，发病后果实也开始腐烂，在第15天时腐烂严重，果实开始渗水。而绿果在接种后15 d仍然未发病。这个结果说明番茄果实不同发育阶段，对灰霉病的抗性不同。绿果期抗性最强；白果期抗病相对绿果较弱，但是白果采后会变色，在转色期抗病性就会减弱，一般白果采后一旦转色，就容易感染灰霉病；红果期果实抗性最弱。

2.2 番茄叶片和果实中的SlCBL1基因表达量分析

番茄不同叶龄叶片中SlCBL1基因表达量差异不大。果实中的SlCBL1基因表达量差异较大，绿果中SlCBL1基因表达量与叶片相比明显升高，随着果实发育，白果中SlCBL1基因表达量最高，红果中SlCBL1基因表达量最低(图3)。根据这个结果，和前面灰霉病发生规律相对应，初步认为SlCBL1基因表达量高低会影响番茄的抗病性。叶片中和红果中SlCBL1基因表达量相对较低，相对应叶片和红果的抗病性较弱。绿果和白果中SlCBL1基因表达量较高，抗病性也较强。白果中SlCBL1基因表达量最高，但是番茄转红后会发病，从图2观察到白果在不转红之前不发病，在变红之后几天开始发病，这可能是因为SlCBL1基因也参与果实的成熟发育，本课题组正在进行此方面的研究。在白果期，SlCBL1基因表达量最高，此时SlCBL1基因的一部分功能用来抗病，一部分功能用来调控果实成熟发育。

2.3 目的基因克隆及番茄稳定转化与转基因植株鉴定

根据NCBI数据库中的番茄SlCBL1基因序列(GenBank登录号NM_001252118.1)，设计引物克隆SlCBL1基因。克隆得到的基因片段大小与目的基因片段大小一致，对基因进行测序分析，测序结果和NCBI数据库中的SlCBL1基因序列比对后一致性为100%。为了缩短后期转基因植株的筛选检测时间，以及检测时更加便利，选择了gataway系列植物表达载体pK7WG2D。pK7WG2D载体上携带有过量表达报告基因eGFP，便于后期转基因植株检测。获得转基因株系10株，并且通过荧光、PCR和q-PCR检测，确认转基因成功。

2.4 转SlCBL1基因番茄的灰霉病抗性分析

对转SlCBL1基因和空载对照的灰霉病抗性分析结果发现，对照不同叶龄叶片接种灰霉病后第4天均开始发病，到第8天发病严重，大部分坏死。转SlCBL1基因番茄的叶片在接种后8 d仍不发病(图4)。结果说明过量表达SlCBL1基因能够提高番茄叶片对灰霉病的抗性。对于果实，因为绿果对照本身不易发病，转基因果实也不发病，在绿果期抗性差异不大。白果期果实，对照在转红之后第2天也就是处理后第4天就开始发病，而转基因果实在处理15 d后依然未发病。红果对照在处理后第5天开始发病，第7天开始发病严重，而转基因红果比对照的发病期推迟了3 d左右(图5)。结果说明SlCBL1基因过量表达也能够提高番茄果实对灰霉病的抗性。

图1 不同叶龄的番茄叶片灰霉病发病规律Fig.1 B. cinerea pathogenesis regularity of different leaf ages of tomato

图2 不同发育阶段番茄果实灰霉病发病规律Fig.2 B. cinerea pathogenesis regularity of different fruit development stages of tomato

对转SlCBL1基因番茄和空载对照叶片和果实中抗病转录因子的表达量分析结果发现，SlCBL1基因过量表达后，叶片中几乎所有抗病转录因子的表达量都上调，上调最明显的是WRKY TF 家族中的SlWRKY33和SlWRKY70基因，表达量上调均超过5倍以上，尤其是SlWRKY33，上调超过10倍(图6)。果实中上调最明显的也是WRKY TF 家族中的SlWRKY33和SlWRKY70。SlWRKY1的上调倍数受果实成熟度影响较大，随着果实成熟，上调倍数增加。尤其在红果中SlWRKY1、SlWRKY33和SlWRKY70的表达量上调更为明显，3个基因表达量上调都超过10倍(图6)。

LA30d. 叶龄30 d； LA50d. 叶龄50 d；LA70d. 叶龄70 d；GF. 小绿果；WF. 白果； RF. 红果；下同图3 番茄叶片和果实中SlCBL1基因相对表达量LA30d. Leaf age 30 days； LA50d. Leaf age 50 days；LA70d. Leaf age 70 days；GF. Green fruit；WF. White fruit； RF. Red fruit；The same as belowFig.3 SlCBL1 gene relative expression in tomato leaf and fruit

转SlCBL1基因植株为株系S3图4 转基因和对照番茄叶片接种灰霉病后发病过程对比SlCBL1 transgenic plant is strain S3Fig.4 Leaf disease process comparison of genetically modified tomato and control tomato after inoculation of B. cinerea

转SlCBL1基因植株为株系S3图5 转基因和对照番茄果实接种灰霉病后发病过程对比SlCBL1 transgenic plant strain S3Fig.5 Fruit disease process comparison of genetically modified tomato and control tomato after inoculation of B. cinerea

通过以上结果能够得出结论，SlCBL1基因过量表达能够提高番茄的抗灰霉病能力。而目前初步研究证明SlCBL1基因调控番茄抗灰霉病主要是通过调控相关抗病转录因子表达量来实现的。分别是番茄WRKY转录因子家族中的SlWRKY1、SlWRKY33和SlWRKY70，ERF转录因子家族中的SlERF1和SlERF5以及NAC转录因子家族中的SlNAC1 和SlNAC4都有不同程度上调。而上调程度最为明显的是WRKY转录因子家族中的SlWRKY33和SlWRKY70这2个基因。这说明在番茄抗灰霉病的过程中SlCBL1、SlWRKY33和SlWRKY70等3个基因都起着非常重要的作用，相互之间也有联系并且相互作用。详细机理有待后续研究。

3 讨 论

CBL基因家族在植物抗逆中起着重要的作用，目前CBL家族的分析研究多集中于拟南芥、水稻和玉米等作物[2-5]，对园艺作物研究较少。番茄作为重要的园艺作物，对其CBL基因功能进行研究，能够为番茄抗逆性改良提供理论依。研究证明，CBL基因除了在非生物逆境中发挥重要作用以外，在植物响应生物逆境胁迫方面也发挥着重要作用[33]，而目前此方面的研究较少。鉴于此，未来可以将研究CBL基因在植物响应生物逆境过程中的作用[34]作为一个重要研究方向。这对解析CBL与植物响应生物逆境胁迫的机制具有重要的意义，CBL在生物逆境胁迫中的探索将成为CBL功能的研究趋势。

图6 转SlCBL1基因番茄叶片和果实抗病相关转录因子表达量分析Fig.6 Analysis of genetically modified SlCBL1 gene tomato leaf and fruit disease resistance related transcription factor expression

目前已经从番茄中分离鉴定出13个CBL基因，并对它们的基因组分布、分子特征、系统进化以及顺式元件进行了分析，为研究番茄CBL的功能提供线索[35]。而尽管相关的研究很多，但是目前几乎所有关于CBL基因的研究都是探讨其在抗旱、抗盐或者是抗低温胁迫中的作用[3,5-6]，很少涉及到其在抗病方面的作用研究。番茄灰霉病作为番茄的重要病害之一，尤其在设施栽培中多发，而且在叶片和果实中都发病，因此给番茄产量造成了很大损失[16-17]。目前，有效的防治番茄灰霉病的方法通常都是药剂防治[22-25]。要从根本上解决灰霉病，只有培育抗病品种才能最大限度地降低其危害，而分子育种是最为直接有效的方法，这就需要我们寻找有效的抗病基因来实现。

本课题组前期的研究证实了番茄中的SlCBL1基因在番茄果实成熟中的作用，该过程中发现SlCBL1基因不仅仅影响番茄果实成熟，而且在抗病方面也起作用。本研究结果表明，SlCBL1在番茄中的功能除了操纵植物的抗逆性，还能够在番茄中起到抗灰霉病的作用。番茄果实中SlCBL1基因过量表达可以提高番茄抗灰霉病能力，初步研究认为是通过SlCBL1基因过量表达调控抗病相关转录因子来增强抗性的。虽然目前本研究还不能够详细解释相关机理，但是对深入解析番茄抗病的分子机理具有参考价值，同时对CBL基因家族的研究提供了一条新的方向和思路。

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(编辑:宋亚珍)

The Role ofSlCBL1 Gene in the Resistance toBotrytiscinereaof Tomato

WANG Yuanhua1,2, YAN Zhiming1,2, XIE Zhenqiang1,2, FENG Yingna1,2, CAI Shanya1,2

(1 Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry, Zhenjiang，Jiangsu 212400，China; 2 Jiangsu Engineering and Technology Center for Modern Horticulture，Zhenjiang，Jiangsu 212400，China)

With tomato (SolanumlycopersicumL.) variety ‘Micro Tom’ as test materials, we analyzed the pathogenesis regularity andSlCBL1 gene expression in tomato leaf and fruit. After inoculation withBotrytiscinerea, we observed the incidence ofSlCBL1 gene in tomato leaves and fruits in transgenic tomato and control. We analyzed the expression change of transcription factor related to disease resistance in transgenic tomato and control. The results show that: (1) for Non-gmo tomatoes, the leaves began to attack after inoculationB.cinerea4 days. Green fruit inoculationB.cinerea15 days still no disease. White fruit began to attack after inoculationB.cinerea11 days. Red fruit began to attack after inoculationB.cinerea5 days.SlCBL1 gene expression in tomato leaves was lower than in fruit, green fruit and white fruit stage is the highest, the red fruit is the lowest. (2) For genetically modified tomatoes, overexpression ofSlCBL1 gene can inhibit the occurrence ofB.cinereain tomato leaves and fruits. Almost all the transcription factor expression was up-regulated in leaves and fruits. WRKY transcription factor family geneSlWRKY33 andSlWRKY70 were strongly up-regulated. The results showed that the over expression ofSlCBL1 gene could improve the ability of the tomato to resist theB.cinerea. And by influencing the disease resistance related transcription factors to regulation tomato resistance toB.cinerea.

tomato；SlCBL1； resistance toBotrytiscinerea

1000-4025(2016)12-2376-09

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2376

2016-09-30;修改稿收到日期:2016-11-17

江苏省自然科学基金(BK20160567);江苏农林职业技术学院院级项目(2014kj15)；江苏高校品牌专业建设工程资助项目(PPZY2015B173)

王媛花(1981-),女，博士，讲师，主要从事园艺植物分子生物学研究。E-mail:wangyuanhua0511@163.com

Q785;Q786

A