钙激活氯通道蛋白ANO1在小鼠主动脉平滑肌细胞的表达及其功能鉴定

张雲乔， 王 胜， 刘艳杰， 崔 爽， 曲 适， 王鑫鑫， 龙 啸， 方 芳， 郝 峰

(1.吉林医药学院生物化学检验教研室， 吉林吉林132013 ； 2.吉林省肿瘤医院， 吉林长春130021 ；3.吉林医药学院附属医院， 吉林吉林132013 ； 4.重庆探生科技有限公司， 重庆九龙坡400039)

钙激活氯通道蛋白ANO1在小鼠主动脉平滑肌细胞的表达及其功能鉴定

张雲乔1， 王 胜2， 刘艳杰3， 崔 爽1， 曲 适1， 王鑫鑫1， 龙 啸4， 方 芳1， 郝 峰1

(1.吉林医药学院生物化学检验教研室， 吉林吉林132013 ； 2.吉林省肿瘤医院， 吉林长春130021 ；3.吉林医药学院附属医院， 吉林吉林132013 ； 4.重庆探生科技有限公司， 重庆九龙坡400039)

探讨钙激活氯通道蛋白ANO1在C57BL/6小鼠主动脉平滑肌细胞中的表达及其功能特性。运用胶原酶消化法获得原代培养的小鼠主动脉平滑肌细胞，流式细胞术检测平滑肌细胞纯度；应用RT-PCR检测主动脉平滑肌细胞ANO1 mRNA的表达；免疫印迹检测ANO1蛋白在主动脉平滑肌细胞的表达情况；应用荧光淬灭动力学实验检测ANO1钙激活氯通道的功能特性。原代培养成功获得主动脉平滑肌细胞；RT-PCR结果分析表明，主动脉平滑肌细胞在mRNA水平有ANO1表达；免疫印迹显示主动脉平滑肌细胞蛋白水平有ANO1表达；荧光淬灭动力学实验证实表达在主动脉平滑肌细胞的ANO1具有阴离子转运功能，即钙激活氯通道典型特性。小鼠主动脉平滑肌细胞表达的ANO1是钙激活氯通道的分子基础。

ANO1蛋白；钙激活氯离子通道；小鼠；主动脉平滑肌细胞

高血压是心脑血管疾病的第一危险因素。血管平滑肌细胞上的离子通道是血管正常收缩舒张来维持血压的重要因素[1]。Cl-是细胞外液主要阴离子，通过跨膜转运和阴离子通道蛋白参与多种生理功能。目前研究发现Anoctamin-1 ( ANOl ) 能够编码CaCCs[2～4]。因此以小鼠主动脉平滑肌细胞作为研究对象，应用分子生物学、免疫荧光化学方法以及荧光淬灭动力学实验，明确ANOl 在主动脉平滑肌细胞的表达，为深入研究该通道功能、明确该通道与高血压的发病机制及靶向治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂 C57BL/6小鼠由吉林大学第二医院实验动物中心提供。兔抗鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体，购自BD公司；anti-ANO1单克隆抗体及HRP标记羊抗兔IgG，购自SANTA CRUZ公司；ionomycin和T16Ainh-A01，购自Millipore公司；Lipofectamine LTX，购自Invitrogen公司；pcDNA3.1-YFP-H148Q/I152L为本实验室前期构建。

1.2 方法

1.2.1 主动脉平滑肌细胞培养及形态学观察和鉴定 采用组织块法与胶原酶消化法联合收集主动脉平滑肌细胞[5]，10%胎牛血清的DMEM/F12培养液于37 ℃、5% CO2环境下培养3 d，倒置显微镜观察细胞形态，流式细胞术检测平滑肌细胞纯度。

1.2.2 逆转录-多聚酶联反应( RT-PCR )检测AN O1表达 应用TRIZol提取RNA。以总RNA为模板，逆转录为cDNA，PCR扩增。参照文献[4]合成ANO1引物序列：上游5′- GGACCTGGGCTATGAGGTTCAG-3′，下游5′-CAGCGCGTCCCCATGGTACTC-3′。内参β-actin 引物序列：上游5′-CATCCTGCGTCTGGACCTG-3′，下游5′-ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3′。RT-PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.3 免疫印迹检测ANO1蛋白的表达 按照BCA蛋白质定量方法测定蛋白质浓度。SDS-PAGE凝胶电泳后转至PVDF膜，封闭2 h，加ANO1单克隆抗体(1∶100)4 ℃过夜。漂洗后加入二抗(1∶500)孵育1 h。继续洗膜，加入底物室温孵育 1 min。采集图像后分析ANO1蛋白的表达。

1.2.4 荧光淬灭动力学实验鉴定ANO1功能 96孔板中细胞数为20 000/孔，培养24 h。将脂质体和pcDNA3.1-YFP-H148Q/I152L加入96孔板，36 h后加入含有5μmol/L ionomycin的高I-溶液，多功能酶标仪动态检测荧光淬灭情况并获取动态曲线。以ANO1特异抑制剂T16Ainh-A01(10 μmol/L)溶液及不含ionomycin高I-溶液作为对照。

2 结果

2.1 主动脉平滑肌细胞分离与培养和鉴定 采用组织块与胶原酶消化法联合，结果显示，获得较多的C57BL/6小鼠原代主动脉平滑肌细胞，胞体较小，呈较规则梭形，贴壁良好，见图 1。流式细胞术检测上述细胞表面标记分子α-SMA表达，抗体染色阳性的细胞为平滑肌细胞，统计分析平滑肌细胞比例为98.7%，见中插彩版图2。

图1 原代培养主动脉平滑肌细胞形态 (×200)

2.2 主动脉平滑肌细胞ANO1的mRNA表达 RT-PCR结果表明，在400 bp附近出现特异性条带，与预期的目的片段大小相符，见图3。证实经原代分离培养的小鼠主动脉平滑肌细胞在mRNA水平上有ANO1稳定表达。

图3 主动脉平滑肌细胞的RT-PCR检测结果

2.3 ANO1蛋白在小鼠主动脉平滑肌细胞的表达 小鼠ANO1蛋白大小为150 kD，根据Western-Blot结果显示，主动脉平滑肌细胞提取蛋白在分离胶相应位置上可见预期大小的清晰条带，证明小鼠主动脉平滑肌细胞在蛋白水平表达有ANO1，见图4。

图4 主动脉平滑肌细胞ANO1蛋白的表达

2.4 主动脉平滑肌细胞ANO1的功能特性鉴定 实验结果显示，加入Ionomycin使荧光强度迅速下降(见图5A)，表明ANO1具有CaCCs内向转运I-的功能，其激活与钙离子密切相关。加入ANO1特异抑制剂，荧光强度无明显变化，进一步明确主动脉平滑肌细胞内流的碘是通过ANO1实现的(见图5B)。上述结果一致表明，表达于ANO1具有钙激活和转运碘离子的特性，符合经典CaCCs特性。

图5 YFP H148Q/I152L鉴定ANO1功能A：稳定表达ANO1的细胞加入Ionomycin荧光猝灭； B：对照组

3 讨论

研究表明，离子通道与血管张力的产生和调节密切相关[4]。Cl-通道作为主要的阴离子通道，开放可导致Cl-外流，驱动膜电位向ECl方向靠近，形成膜的去极化从而引起平滑肌的收缩，对血管收缩反应具有重要的调节作用。目前研究认为，氯通道结构的改变和功能的紊乱可导致原发性高血压，因此氯通道将成为高血压研究领域的新焦点、治疗的新靶点。

血管平滑肌细胞主要存在两种阴离子通道，即容积调节的Cl-通道和Ca2+激活Cl-通道[6-7]。其中 CaCCs可以被细胞膜电位去极化和细胞内游离钙离子浓度升高所激活，造成平滑肌细胞收缩，血管张力增大，对心血管疾病的发生、发展起到重要调节作用。但是由于CaCCs的分子基础长期未得到证实，导致CaCC的分子结构与功能和疾病之间的关系等研究都无法深入展开。直到2008年Nature、Science和Cell同时报道：CaCCs通道是由ANO1蛋白构成[2]，这一发现为特定细胞和组织中研究氯离子通道的生理病理相关问题及其作用机制提供了新的研究平台。本实验以小鼠原代培养的主动脉平滑肌细胞为研究对象，在mRNA和蛋白水平证实小鼠主动脉平滑肌细胞存在 ANO1 的表达，并应用功能试验证实ANO1 确具有 CaCCs 通道的功能特性。因此，认为主动脉平滑肌细胞表达ANO1蛋白，并且发挥内源性 CaCCs作用。本研究结果为深入探讨血管平滑肌细胞CaCCs在高血压形成机制中的作用，及临床高血压病的防治研究提供基础。目前推测CaCCs可能是引起、维持较高血管张力和外周血流阻力的因素之一，阻断CaCCs通道可引起外周血管舒张，激活CaCCs通道则引起外周血管收缩，CaCCs在外周血管平滑肌细胞张力的产生、维持及调节方面起着重要作用[4]。总之，随着对CaCCs研究的不断深入，其生理学和药理学特点及其在动脉张力中的作用会被逐渐揭示，为高血压等心血管疾病的研究提供新方向和线索。

[1] Schroeder B C，Cheng T，Jan Y N，etal．Expression cloning of TMEM16A as a calcium-activated chloride channel subunit[J]．Cell，2008，134(6)：1019-1029．

[2] Zhang Y P 1，Zhang H，Duan D D．Chloride channels in stroke[J]．Acta Pharmacol Sin，2013，34(1)：17．

[3] Pedemonte N，Galietta L J．Structure and function of TMEM16 proteins (anoctamins)[J]．Physiol Rev，2014，94(2)：419-459．

[4] Picollo A，Malvezzi M，Accardi A．TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions[J]．J Mol Biol，2015，427(1)：94-105．

[5] 姜勇，张鑫，苏瑞，等．大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及诱导分化研究[J]．南京大学学报，2009，45(4)．

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[7] 侯毅鞠，郝峰，许会静，等．钙激活氯离子通道ANO1在小鼠心急细胞的表达及其功能鉴定[J]．中国病理生理杂志，2015，31(3)：539-542．

2016-03-18

吉林省卫生计生科研计划(2014Z103)；吉林省教育厅基金资助(2013-351)；国家自然科学基金资助项目(81202031)；2016年吉林医药学院国家级大学生创新创业训练计划(NO.201613706020)

张雲乔(1993-)，女，本科，主要从事离子通道的结构和功能研究，E-mail：1017794752@qq.com

郝峰，E-mail:haof863@126.com

R337.5

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0529-6005(2016)12-0087-02