Micro-CT分辨率对松质骨微观结构测量的影响

阎国强 ， 舒 熊 ， 刘莉莉 ， 赵丹慧， 谢富强

(1. 北京市创伤骨科研究所， 北京西城100035; 2. 北京积水潭医院， 北京西城100035；3.中国农业大学动物医学院， 北京海淀100193)

Micro-CT分辨率对松质骨微观结构测量的影响

阎国强1,2， 舒 熊1,2， 刘莉莉2， 赵丹慧1,2， 谢富强3

(1. 北京市创伤骨科研究所， 北京西城100035; 2. 北京积水潭医院， 北京西城100035；3.中国农业大学动物医学院， 北京海淀100193)

目的：探索Micro-CT在研究小鼠骨小梁结构参数时的最适分辨率。方法：Micro-CT扫描正常小鼠股骨得到松质骨结构参数, 扫描分辨率为5 μm，通过对合并像素点将分辨率降低至10 μm到50 μm，分别测量不同分辨率下松质骨标本的结构参数，应用统计学分析比较结构参数在不同分辨率下的差异。结果：随着分辨率从5 μm到50 μm按5 μm一个梯度的降低，BV/TV、BS/BV、Tb.N和Tb.Pf呈现下降趋势，Tb.Th和Tb.Sp呈现上升趋势，而SMI和DA的变化趋势不明显。BS/BV、Tb.N和Tb.Pf分别在40 μm、20 μm和10 μm时与对照组出现明显统计学差异，Tb.Th和Tb.Sp也分别在25 μm和50 μm时出现显著性差异，BV/TV、SMI和DA未出现显著性差异。结论：该试验证实了不同分辨率对Micro-CT测量小鼠松质骨显微结构有显著影响。Tb.Pf对分辨率的变化敏感度很高，最合适分辨率为5 μm；若不考虑Tb.Pf，其余七个参数的最合适分辨率是20 μm。

小鼠；松质骨；Micro-CT；结构参数；分辨率

传统的组织形态学在评价骨组织微观结构形态方面有很多不足。因为松质骨的主要特点在于其骨结构的多孔性[1-3]，而骨小梁的结构如只能显示很小一部分的组织形态，且只是在二维(two dimension, 2D)层面做出诊断，不能确切地描述骨小梁的三维立体结构。

近年来微型计算机断层扫描(micro-computed tomography, Micro-CT)在科学研究中的应用日趋广泛，如骨骼、牙齿和生物材料等领域[4]。和其他检测手段相比，Micro-CT的独到之处在于，能够以非常高的分辨率对标本进行检测的同时，不破坏检测对象的内部结构[5]。

伴随Micro-CT在松质骨小梁的分辨率的要求也越来越高(几微米到亚微米级)。而使用高分辨率的直接结果就是图片像素高，占用存储空间大。当使用软件对数据进行分析时，一个标本往往要花数个小时甚至十几个小时，导致分析的效率显著下降。为了解决这个问题，本试验采用原始高分辨率图像通过合并像素点降低分辨率后再进行分析，寻求最适合的分析分辨率，以达到既不影响数据的准确性，又能大大节省分析数据的时间。

1 材料与方法

1.1 标本准备

SPF级C57雌性小鼠5只，体重(18～25)g，3月龄。均购自北京维通利华实验动物中心[SCXK(京)2013-0011]，饲养于北京积水潭医院动物实验室SPF屏障设施[SYXK(京)2012-0027]内的IVC笼盒内，个体自由取水和饲料，24 h恒温恒湿。室温维持在(25±2)℃，湿度保持在(55±5)%，每天保持12 h的昼夜循环。

适应性饲养2周后，麻醉并实施安乐死术，取左侧后肢去除软组织后，将股骨置于福尔马林中固定。扫描前将标本从福尔马林中取出并置于生理盐水中过夜。所有操作符合实验伦理委员会的要求。

1.2 Micro-CT扫描

将左侧股骨放置于圆柱形的聚丙烯扫描杯中，使用Micro-CT(SKYSCAN 1172，Belgium)扫描，扫描范围是股骨远端1/3部分。扫描参数包括：球管电压45 kv；电流165 μA；曝光时间500 ms；旋转角度和步长分别是180°和0.4°；采用0.5 AL的filter；扫描分辨率为5 μm。扫描完毕后，采用设备自带的重构软件NRecon(V1.6.9.4)对扫描图像进行重构得到立体分辨率为5 μm的bmp图像。

使用CTan(V1.14.4)对数据进行分析，兴趣区域(Region of Interest,ROI)为股骨远端生长板上方100层至500层(共401层，见图1)，厚度为2 005 μm的皮质骨内侧松质骨。将原始图像的分辨率按5 μm一个梯度降低，得到每个标本5 μm、10 μm、15 μm、20 μm、25 μm、30 μm、35 μm、40 μm、45 μm、50 μm的图像。本试验中按分辨率共分10个组，其中5 μm组为对照组。通过Micro-CT自带的软件CTan计算8个结构参数(BV/TV、BS/BV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N、Tb.Pf、SMI和DA)(见表1)。

表1 小鼠骨小梁结构参数

图1 小鼠股骨远端骨小梁ROI选取范围(以生长板为基准线)

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 10.0进行数据分析。比较不同的分辨率组和对照组(5 μm)之间的差异。在此方法中，图像分辨率的改变是一个被处理因素，采用单因素方差分析进行比较,当P<0.05时，差异有显著意义；当P<0.01时，差异有极显著意义。

2 结果

从小鼠股骨远端骨小梁的立体图中可看到(见图2)，随着分辨率的降低，骨小梁丢失逐渐增加，同时伴随分辨率的降低，各结构参数的变化不尽相同。 在本试验中，随着分辨率的降低，BV/TV、BS/BV、Tb.N和Tb.Pf呈现下降趋势，Tb.Th和Tb.Sp呈现上升趋势，而SMI和DA的变化趋势不明显。BS/BV、Tb.N和Tb.Pf分别在40 μm、40 μm和10 μm时与对照组出现明显统计学差异。Tb.Th和Tb.Sp也分别在25 μm和50 μm时出现显著性差异见图2。而在本试验中，随着分辨率降低，BV/TV、SMI和DA未出现显著性差异。Tb.Pf对分辨率的变化敏感度很高，最适分辨率为5 μm；若不考虑Tb.Pf，其余7个参数的最适分辨率是20 μm(见表2)。

图2 小鼠股骨远端骨小梁立体图(5 μm、10 μm、15 μm、20 μm、25 μm、30 μm、35 μm、40 μm、45 μm、50 μm)

图3 各结构参数随分辨率降低的变化趋势
(*:P<0.05， **:P<0.01)

表2 各结构参数适用的分辨率范围

3 讨论

Micro-CT是一台精密仪器，可用于骨科学、材料学等领域。有不少学者发现，Micro-CT得出的结构参数都对分辨率有强烈的依赖性[6]。但高精度的扫描数据导致扫描和重建的数据量庞大，分析时间耗费巨大。例如在本试验中，使用Micro-CT进行小鼠股骨远端分辨率为5 μm扫描并重建后的数据约占用硬盘空间12GB，而对这一数据进行CTan软件分析时，一个样本则耗时近10个小时，而这只是一个样本的数据。若进行整体实验数据分析时，不论是对数据的储存空间还是分析时间，都是一个难题。所有我们推测，在理论上存在一个临界分辨率，采用此临界分辨率，既不影响数据的准确性，又能大大节省分析数据的时间。

Perilli E[7]曾做过关于关于人腰椎结构参数随着分辨率变化的试验，他采用17 μm，34 μm，68 μm三个分辨率对骨小梁的BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N和SMI这5个参数进行比较分析，随分辨率降低的变化趋势和本试验基本一致，但都在分辨率降低一倍时，即34 μm时都出现了显著差异或极显著差异。而本试验中发现BV/TV、SMI对分辨率的变化不敏感，即在10-50 μm范围内未出现显著差异，且Tb.Th、Tb.Sp和Tb.N分别在25 μm、50 μm和40 μm时出现显著差异，即他们分别是在5倍、10倍和8倍最高分辨率时出现显著差异。差异的原因可能有以下几点：一、动物间的种属差异。本试验采用的C57小鼠属于近交系，个体差异很小。相比之下，人类脊柱的椎体骨小梁之间的差异会略大；二、机器型号的差异。本试验使用的机器是专门用来扫描离体样本的Micro-CT 1172，而Perilli E所使用的MIcro-CT 1076主要适用于活体样本的扫描。对离体样本来说，两者在分辨率和精确性上差异较大；三、骨小梁厚度的差异。正常小鼠骨小梁厚度约30～40 μm，而人类骨小梁的厚度约80～120 μm。本试验中可看到，随着分辨率的降低，骨小梁丢失逐渐增加。同时伴随分辨率的降低，各结构参数的变化不尽相同。但分辨率在20 μm时，除Tb.Pf外的七个结构参数并未表现出显著差异。因此，本试验认为当无Tb.Pf时，进行正常小鼠骨小梁分析时的最适分辨率为20 μm。

当然，本试验尚存在一些不足之处。由于电脑运行速度的影响因素较多，如电脑配置、温湿度、电脑运行时间等，本试验未对各分辨率节省的时间做统计分析。另外，未对有骨质疏松的小鼠进行比较。下一步我们将分析不同的骨小梁结构和动物种属与分辨率之间的关系。

[1] Nikodem A. Correlations between structural and mechanical properties of human trabecular femur bone [J]. Acta of Bioengineering & Biomechanics, 2012, 14(2): 37-46.

[2] Keaveny T M, Morgan E F, Niebur G L,etal. Biomechanics of trabecular bone [J]. Annual Review of Biomedical Engineering，2001, 3(1): 307-333.

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[5] Isaksson H, T Yr S J, Hakulinen M,etal. Structural parameters of normal and osteoporotic human trabecular bone are affected differently by microCT image resolution [J]. Osteoporosis International, 2011, 22(22): 167-177.

[6] Tjong W, Kazakia G J, Burghardt A J,etal. The effect of voxel size on high-resolution peripheral computed tomography measurements of trabecular and cortical bone microstructure [J]. Medical Physics, 2012, 39(4): 1893-1903.[7] Perilli E, Parkinson I H, Reynolds K J. Micro-CT examination of human bone: from biopsies towards the entire organ [J]. Annali Dellistituto Superiore Di Sanità, 2012, 48(1): 75-82.

Theeffect of micro-CT resolution on measuring microstructure parameters of trabecular Bone

YAN Guo-qiang1, SHU Xiong1, LIU Li-li2, ZHAO Dan-hui1,XIE Fu-qiang3

(1. Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035 China; 2. Beijing Institute of Traumatology and Orthopedics, Beijing 100035, China; 3.College of Veterinary Medicine，China Agriculture University，Beijing 100193，China)

To explore the optimal resolution of Micro-CT in the study of the structural parameters of trabecular bone in mice.The trabecular bone of mice was scanned by micro-CT with the scanning resolution of 5μm, decreasing the resolution to 10μm ～50μm through the study of the multiplication of resolution so as to obtain the reduced-resolution micro-CT data. Then, the microstructural parameters were calculated by these images. Then the differences of structural parameters by these micro-CT data of different resolution were analyzed. Different parameters had different correlations with variations of the resolution. The value of BV/TV, BS/BV, Tb.Th and Tb.Pf declined, while the value of Tb.Pf and Tb.Sp increased when decreasing the resolution. In addition, there was no effect on the SMI and DA with variations of the resolution. BS/BV, Tb.N and Tb.Pf had statistically significant difference in 40μm, 20μm and 10μm compared with control group, respectively. Tb.Th and Tb.Sp had significant difference respectively in 25μm and 50μm, and BV/TV, SMI and DA had no significant difference. There is a significant effect of different resolutions on the accuracy of the micro-CT, when measuring the microarchitectural parameters of the trabecular bone. The change of Tb.Pf resolution sensitivity is high, the most suitable resolution was 5μm; without considering Tb.Pf, the most appropriate resolution of the remaining seven parameters is 20μm.

Mice; Trabecular bone; Micro-CT; Architectural parameters; Resolution

s:ZHAO Dan-hui; XIE Fu-qiang

2016-11-15

阎国强(1982—)，男，技师，硕士，研究方向为动物影像学和实验动物，E-mail：117629867@qq.com

赵丹慧，E-mail：zhaodanhui@263.net；谢富强，E-mail：xiefuqiang@cau.edu.cn

S858.32

A

0529-6005(2016)12-0063-03