几种蒲公英成分的提取及体外抑菌效果试验

侯京玲 ， 周霄楠 ， 赵兴华 ， 钟秀会

(河北农业大学动物医学院 ， 河北保定071001)

几种蒲公英成分的提取及体外抑菌效果试验

侯京玲 ， 周霄楠 ， 赵兴华 ， 钟秀会

(河北农业大学动物医学院 ， 河北保定071001)

研究蒲公英不同成分的抑菌效果，通过水提、醇提、超声波提取法等提取蒲公英多糖、蒲公英黄酮、蒲公英酚酸，并利用平板打孔法研究各提取物对沙门菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。结果表明，蒲公英多糖对这5种菌均未见抑制效果。蒲公英黄酮对痢疾杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用，对沙门菌未见抑菌性。蒲公英酚酸对以上5种菌均显示抑制作用。

蒲公英多糖 ； 蒲公英黄酮 ； 蒲公英酚酸 ； 抑菌作用

畜禽养殖生产中抗生素广泛应用。但是，大量应用抗生素可使畜禽体内的微生物产生耐药性，同时造成畜产品中抗生素药物残留，影响动物源性食品安全。因此，在养殖过程中减少抗生素的使用势在必行，农业部最近表示，为提升消费者对畜牧产品的信赖，拟计划全面禁止在动物饲料中添加抗生素。并于2015年制订了抗生素治理5年规划。许多研究都在致力于寻找抗生素的替代品。中药一直为保障畜牧健康养殖发挥着巨大作用，且中药没有化学药物的耐药性等弊端，因此受到许多学者的重视。

蒲公英作为清热解毒类药物被许多学者所关注。蒲公英味苦、甘，性寒，具清热解毒，消肿散结，利尿通淋之功效。用于疔疮肿毒、乳痈、瘰疬、目赤、咽痛、肺痈、肠痈、湿热黄疸、热淋涩痛。医学研究表明，蒲公英具有广谱抑菌作用，对革兰阳性和革兰阴性菌、皮肤真菌、螺旋体均有不同程度的抑制作用，且不易产生耐药性。对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、表皮葡萄球菌、卡他球菌等具有较强的杀灭作用，对幽门螺杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌、沙门菌等临床常见感染菌也有不同程度的抑制作用[1]。目前，对蒲公英抗菌活性的研究多以药材粗提物或不同极性部位的提取液为研究对象，对单一抑菌成分的研究较少。如孙继梅[2]等利用水煎法提取蒲公英活性成分，进行体外抑菌试验，试验表明，蒲公英在体外对临床常见感染菌，尤其是革兰阳性、革兰阴性球菌有较好的抑菌活性。孙长霞[3]等采用不同溶剂提取蒲公英的有效成分并进行体外抑菌试验，试验结果显示，蒲公英水提物及醇提物均具有抑菌作用。蒲公英的抑菌活性成分包括多糖类、酚酸类、黄酮类、植物甾醇类、倍半萜内酯类。早期研究多集中在以绿原酸为代表的有机酸类的抑菌活性方面，近年来研究范围逐渐扩展到多糖类、黄酮类成分。吴杰[4]利用水提醇沉法提取蒲公英的多糖，脱蛋白处理后，进行抑菌试验研究，试验结果显示，蒲公英多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均具有明显的抑菌作用。李华峰[5]对蒲公英花不同提取部位的抗菌活性进行研究，表明乙酸乙酯相抗菌活性显著高于水相和石油醚相，进一步说明了黄酮类化合物是其抑菌主要成分。

尽管蒲公英在世界各地均大量分布，但作为天然药物为大众所广泛使用甚至世界各国所接受，尚需做很多基础研究。本试验采用水提醇沉法、超声波提取法等方法提取蒲公英的3种成分：蒲公英多糖、蒲公英黄酮和蒲公英酚酸。并测定了这3种成分对5种致病细菌的抑菌效果，旨在为开发和研制新型中药抑菌剂，拓宽蒲公英的使用范围，提供基础资料和参考。

1 材料与方法

1.1 中药蒲公英饮片样品(购自河北省保定市安国中药材市场) 培养基：营养肉汤琼脂培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司)。菌种：沙门菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌和金黄色葡萄球菌。菌种由河北农业大学动物医学院微生物实验室提供。

1.2 蒲公英多糖的提取 称取干燥蒲公英100 g，粉碎过40目筛备用置于圆底烧瓶中，加石油醚回流两次，每次1 h，脱去脂肪。然后用 80%乙醇回流，以除去样品中的单糖、寡糖以及其他小分子物质。加入蒸馏水3 000 mL，80 ℃提取3 h，抽滤，重复2次，合并滤液。Sevage法向提取液中加入1/4体积的氯仿-正丁醇(v/v4∶1)混合20 min，3 500 r/min离心5 min，去除中层白色絮状蛋白质沉淀，取上清，反复5、6次，至中间无沉淀为止。脱蛋白完毕后向提取液中缓缓加入95%乙醇，并用玻璃棒缓慢搅拌，使乙醇浓度达到80%，静置4 h，4 000 r/min离心5 min，沉淀得粗多糖。离心沉淀物，离心洗涤数次，即得蒲公英多糖[6]。根据蒽铜-硫酸法[7]检测蒲公英多糖的含量。

1.3 蒲公英黄酮的提取 取干燥蒲公英干粉100 g，在乙醇体积分数65%，料液比1:35，超声时间35 min，超声温度60 ℃条件下，提取4次。然后抽滤，得黄酮提取液[8]。

大孔树脂D101湿法灌柱2/3，保持柱子湿润，在上1/3上样，样品的pH值为3，浓度液料比为3:1即300 mL，先用蒸馏水洗脱，再用40%～70%的乙醇洗脱，蒸馏水洗脱液弃去，收集乙醇洗脱液，用三氯化铁检验洗脱液成灰绿色时收集，再将洗脱液浓缩得到黄酮浓缩液，将黄酮浓缩液放到100 ℃恒温水浴锅中加热，得黄酮粗品[9]。根据紫外分光光度计法测量蒲公英黄酮含量[10]。

1.4 蒲公英中酚酸的提取 准确称取100 g干燥蒲公英粉末，平均放入两个500 mL圆底烧瓶中，按1∶14的料液比添加60%乙醇，调节pH值到2，然后置超声波提取器中，超声温度为50 ℃超声提取50 min，取出，抽滤得滤液[11]，浓缩滤液使得浓度为料液比1∶3，即为300 mL，然后过柱(柱子同上1.2.2，树脂为DA-201大孔树脂，洗脱液为80%乙醇[12])，用三氯化铁检验洗脱液呈深绿色时收集，收集洗脱液后浓缩得酚酸浸膏。根据紫外分光光度计法测量蒲公英酚酸含量[13]。

1.5 黄连水提物的制备 准确称取100 g干燥的黄连饮片，加入适量的蒸馏水煎煮1 h，过滤，反复3次，浓缩滤液，得到1 g/mL的水提物，备用。

1.6 菌种活化培养和菌液的制备 将沙门菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌和金黄色葡萄球菌分别接种到营养肉汤培养基上，37 ℃培养24 h后，用比浊法将各菌株用无菌水配制成106CFU/mL菌悬液，备用。

1.7 体外抑菌试验 在超净工作台上向牛肉膏蛋白胨平板中加入0.2 mL细菌的菌悬液，L型涂布器涂布均匀。用打孔器在培养基上等距打5个孔，孔中分别滴入1 g/mL的蒲公英提取物、蒸馏水和黄连水提物。其中蒸馏水作为阴性对照，黄连1 g/mL水提物为阳性对照。重复3次，计算平均抑菌圈直径。

2 结果

2.1 蒲公英有效成分的含量测定结果 100 g蒲公英全草中得到蒲公英多糖的干物质6 g，含量为 25.3%；蒲公英黄酮的粗品4.25 g，含量为3.4%；蒲公英酚酸浸膏17.37 g，含量为3.2%。

2.2 蒲公英3种成分的抑菌效果 蒲公英多糖对金黄色葡萄球菌、沙门菌、大肠杆菌、葡萄球菌、痢疾杆菌这5种菌均未显示抑制效果。蒲公英黄酮对沙门菌未见抑菌性，对其他4种菌均显示不同程度的抑菌性。蒲公英酚酸对以上5种菌具有不同程度的抑菌效果，其中蒲公英酚酸的抑菌效果最强。黄连水提物作为阳性对照药物，在本试验中，仅对2种葡萄球菌和大肠杆菌表现出抑菌效果。见表1.

3 讨论

蒲公英在全国大部分地区均有分布，共有70余种，其中以蒙古蒲公英分布最广，临床上应用也最多。现代药理研究表明，蒲公英具有广谱抑菌作用，对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌均有效且不产生耐药。蒲公英还有利胆保肝[14]，抗内毒素，健胃和免疫促进等作用[15]。

表1 蒲公英不同提取物对5种菌的抑菌圈直径 (mm)

近年关于蒲公英抑菌作用的研究很多，以蒲公英提取物为最，但多数并没有明确的鉴定蒲公英提取物中何种成分有抑菌作用。宋晓勇[16]等采用纸片法和琼脂稀释法考察了蒲公英多糖的抗菌活性，结果显示，蒲公英多糖抑菌活性良好，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、沙门菌、链球菌均有不同程度的抑制作用。蒲公英寡糖也对大肠杆菌和葡萄球菌等显示抑菌作用[17]。蒲公英的醇提物对金黄色葡萄球菌等具抑菌活性，似乎与所含酚酸有关。本试验对蒲公英的3种主要活性成分进行了初步鉴定和抑菌效果研究。结果显示，蒲公英多糖对金黄色葡萄球菌、沙门菌、大肠杆菌、葡萄球菌、痢疾杆菌这5种菌均未显示抑制效果。蒲公英黄酮对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、葡萄球菌、痢疾杆菌均具有一定的抑制作用，且对葡萄球菌的抑制作用最强。蒲公英酚酸对以上5种菌具有抑菌效果，且对葡萄球菌的抑制作用最强。本研究结果中，蒲公英多糖未显示抑菌效果，与上述文献报道[16]结果并不一致，这是否因为本研究的提取方法不同，有待继续试验验证。

蒲公英的主要活性成分是多糖类、黄酮类、有机酸和甾醇类物质，经初步鉴定有机酸为绿原酸。蒲公英中多糖含量丰富、提取简单，在抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、降糖等方面具有很好的研究意义。蒲公英黄酮资源广、提取方便、抗氧化作用显著具有良好应用前景。绿原酸具有广谱抗菌和利胆作用，是蒲公英抗菌的主要有效成分。近年国内外学者中有很多关于绿原酸抑菌的研究。中药的提取方法决定了药液的成分和含量，提取剂的选择直接影响药物有效成分的含量，从而影响药物的作用效果[18]。蒲公英水提物在体内通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，对于LPS诱导的小鼠肺炎显示出抗炎作用[19]。中药抑菌有效成分在体内和体外的作用存在差异，其原因尚待深入研究。

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Research on Antibacterial Activity of different Herba Taraxaci extracts in Vitro

HOU Jing-ling , ZHOU Xiao-nan , ZHAO Xing-hua , ZHONG Xiu hui

(AgriculturalUniversity of Hebei, College of Veterinary Medicine, Baoding 071001, China)

Water extraction, alcohol extraction,and ultrasonic extraction methods were used to extract the polysaccharides,phenolic acids,and flavonoids from dandelion. Disk diffusion method was adopted to study the bacteriostatic effect of Taraxacum extraction onSalmonella,Dysenterybacillus,Escherichiacoli,Staphylococcus,andStaphylococcusaureus. The results showed that Dandelion polysaccharide had no inhibitory effect on the five kinds of bacteria. Dandelion flavonoids had bacteriostasis todysenterybacillus,Escherichiacoli,staphylococcus, andstaphylococcusaureus,while had no bacteriostasis to Salmonella. Dandelion phenolic acids had inhibitory effect on the above five kinds of bacteria.

Dandeloin; Dandelion polysaccharide; Dandelion flavonoids; Dandelion phenolic; bacteriostasis

ZHAO Xing-hua

2015-12-02

河北省教育厅高等学校科学技术研究优秀青年基金项目(YQ2013019)；河北省科技计划项目(13226624)

侯京玲(1986-)，女，硕士，研究方向为中药药理学， E-mail:15232973536@163.com

赵兴华，E-mail:dyzhaoxh@hebau.edu.cn

R285.5

A

0529-6005(2016)12-0053-03