鸡白介素10(chIL-10)单克隆抗体的制备及鉴定

高俊峰 ， 柳亚楠 ， 王永强 ， 曹 红 ， 李晓齐 ， 郑世军

(中国农业大学动物医学院农业生物技术国家重点实验室 ， 北京海淀100193)

鸡白介素10(chIL-10)单克隆抗体的制备及鉴定

高俊峰 ， 柳亚楠 ， 王永强 ， 曹 红 ， 李晓齐 ， 郑世军

(中国农业大学动物医学院农业生物技术国家重点实验室 ， 北京海淀100193)

为制备鸡白介素10(chIL-10)单克隆抗体，以常规分子生物学技术从禽细胞系MDCC-MSB1 克隆chIL-10 基因，将去信号肽chIL-10基因亚克隆至原核表达载体pET-30a，并在大肠杆菌中表达，纯化后作为免疫原免疫BALB/c 小鼠。经4次免疫后，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合。将原核表达的GST-chIL-10融合蛋白作为包被抗原，利用间接ELISA 筛选阳性克隆。阳性细胞株经3次亚克隆后，获得3株稳定分泌chIL-10 抗体的杂交瘤细胞克隆，分别命名为4B2、4F3 以及1E3。经间接ELISA 测定，以上3 株杂交瘤细胞腹水效价为1∶3.2×106，亲和力解离常数(Kd)分别为1.05×10-9、5.01×10-10以及7.59×10-10。抗体重链类型分别为IgG2a、IgG2a以及IgG1。经Western Blot 试验证明，3株单抗均能特异地识别原核或真核表达的chIL-10蛋白，4B2、4F3单抗识别的抗原表位区域为chIL-10 N端的1 aa～52 aa，1E3识别的是N端的52 aa～102 aa。这些单抗为鸡IL-10的检测及生物学功能研究奠定了基础。

鸡IL-10 ； 原核表达 ； 单克隆抗体

Fiorentino 等首先描述了IL-10 是由Th2 细胞分泌的细胞因子[1]。LisaRothwell 等从感染艾美耳球虫的鸡盲肠扁桃体提取总RNA，经RT-PCR 获得chIL-10 的全长cDNA 序列，其编码一条175 个氨基酸的多肽，其中有21 个氨基酸组成信号肽，成熟肽段长154个氨基酸。鸡IL-10与人IL-10以及鼠IL-10 的氨基酸序列同源性分别为45%和42%。鸡基因组DNA 中IL-10 基因包含5 个外显子和4个内含子，与哺乳动物类似，但其排列更加紧密[2]。

IL-10 对免疫细胞有多方面的调节作用[3]，但对免疫应答主要起抑制作用。在有关HIV的研究中显示，HIV 刺激树突状细胞产生IL-10，从而使多种免疫功能受到抑制[4]。相关研究表明，SPF鸡感染禽网状内皮组织增殖病毒后，外周血单核细胞中的IL-10 的转录水平会上调[5]。本研究克隆了鸡IL-10 基因，在大肠杆菌中进行了表达，制备了chIL-10 单克隆抗体，并鉴定了单抗特性，为进一步研究鸡IL-10的生物学功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、细胞、质粒及实验动物E.coliDH5α和E.coliRosetta(DE3)，骨髓瘤细胞SP2/0 和HEK293T细胞，MDCC-MSB1的cDNA，pGEX-6p-1和pRK5-flag 质粒，由本实验室保存，pET-30 质粒由中国农业大学细胞与分子生物学实验室唐军教授惠赠；BALB/c 小鼠，购自中国医学科学院实验动物研究所。

1.2 主要试剂及仪器 弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT、HT 以及免疫球蛋白亚类分析试剂盒，购自Sigma 公司；PEG4000，购自MERCK 公司；DMEM，购自Invitrogen 公司；胎牛血清，购自HyClone 公司；非必须氨基酸，购自Gibico 公司；鼠源His-tag 以及GST-tag 单抗，购自Abmart 公司；flag-tag单抗，购自Sigma 公司；HRP 标记山羊抗小鼠IgG 以及HRP 标记马抗山羊IgG，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；压力搅拌式浓缩杯，购自默克化工技术(上海)有限公司；酶标板，购自美国Costar 公司；酶标仪，购自美国TECAN公司。

1.3 原核表达载体构建及蛋白纯化 以MDCCMSB1的cDNA 为模板，根据NCBI 上发布的禽源IL-10 序列(NM_001004414.2)设计引物：F-5′-TTGGAGCCCACCTGCCTGCACTTCT-3′ ；R-5′-TCACTTCCTCCTCCTCATCAGCAGG-3′扩增去除chIL-10基因中编码信号肽的部分，分别构建到pET-30a和pGEX-6p-1 原核表达载体上，转化至Rosetta(DE3)进行表达，提取的包涵体按照文献[6]所述方法进行稀释复性，获得重组蛋白。

1.4 chIL-10 单克隆抗体的制备 小鼠免疫程序按文献[7]所述方法进行。细胞融合、阳性杂交瘤细胞的筛选按文献[8]所述方法进行。腹水的制备和纯化按文献[8-9]所述方法进行。

1.5 chIL-10单克隆抗体的鉴定

1.5.1 单克隆抗体Ig 亚类鉴定 按照Sigma 公司的小鼠单抗亚类鉴定试剂盒说明书进行单抗重链亚类的鉴定。

1.5.2 单克隆抗体亲和力的测定 利用间接ELISA 方法测定单抗的亲和力：以2 μg/mL GSTchIL-10蛋白包被酶标板，封闭后加入倍比稀释纯化的单抗，以HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗，酶标仪读取OD450nm 吸光值。数据的处理分析按照文献[10]所述方法。

1.5.3 单克隆抗体的特异性鉴定 以原核表达的重组鸡白介素10(His-chIL-10)，鸡白介素2(His-chIL-2)，鸡白介素4(His-chIL-4)，鸡干扰素beta(His-chIFN-β)为抗原，经SDS-PAGE 后转印至PVDF 膜；分别以His-tag 单抗和纯化的1E3、4F3以及4B2 chIL-10 单抗为一抗；以HRP-山羊抗小鼠IgG为二抗；以化学发光法暴光感光胶片。

1.5.4 单克隆抗体识别真核细胞表达的chIL-10 将消化好的HEK293T细胞，按照每孔大约8×105个细胞接种于6 孔板，待细胞密度达到70%左右时，按照Vigofect 的转染方法转染pRK5-flag-chIL-10 试验组和pRK5-flag 对照组质粒。转染24 h 后收取细胞蛋白，经SDS-PAGE 后转印至PVDF 膜；分别以flag-tag 单抗、纯化的1E3、4F3 以及4B2 chIL-10 单抗为一抗；以HRP-山羊抗小鼠IgG为二抗；以化学发光法暴光感光胶片。

1.5.5 单克隆抗体抗原识别区的确定 以chIL-10 不同截短的重组蛋白为抗原，以制备的单抗为一抗，通过Western Blot 分析两株单抗可能识别的抗原表位所在区域。

2 结果

2.1 chIL-10单克隆抗体的制备及特异性鉴定 如图1所示，3株单抗纯化效果较好且均能特异识别原核表达的chIL-10。

2.2 单克隆抗体亚类鉴定及亲和力测定 4B2、4F3 与1E3 杂交瘤细胞株分泌的单抗亚类分别为IgG2a、IgG2a 和IgG1。3 株单抗亲和力解离常数(Kd)分别为1.05×10-9、5.01×10-10以及7.59×10-10(图2)，均属于高亲和力抗体。

2.3 单克隆抗体识别真核细胞表达的chIL-10 如图3 所示，3 株单抗均能识别真核表达的chIL-10。

2.4 单克隆抗体抗原识别区的确定 用分子生物学技术将chIL-10 蛋白截短并在原核细胞中表达，用Western Blot 方法检测3 株单抗对于截短蛋白的识别情况，4B2、4F3 识别的抗原区域为chIL-10 N-端的1 aa～52 aa，1E3 识别的抗原区域为chIL-10 N-端的52 aa～102 aa。

图1 单抗的纯化和特异性鉴定

图2 chIL-10单克隆抗体亲和力测定

3 讨论

树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞等细胞可以分泌IL-10，然而Th2 细胞是分泌IL-10 的主要来源[11-13]。IL-10 能够抑制Th1 细胞因子譬如IL-2与IFN-γ的合成[14]。IL-10 抑制单核/巨噬细胞释放炎症介质，并因此抑制了LPS 和IFN-γ诱导其分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、G-CSF 和GM-CSF[15]。此外，IL-10可以阻止B 细胞凋亡，增强其增殖、分化和MHC II 类分子的表达，而且在Ig 类别转换中起着积极的作用[16]。淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)感染早期可以诱导IL-10的表达，引起免疫抑制，使病毒逃离机体的免疫机制，而长期持续性存在于体内[17]。由此可见，IL-10 在调节免疫系统中发挥重要作用，并与病毒的持续性感染有关。

图3 单克隆抗体识别真核细胞表达的chIL-10

图4 单抗抗原表位识别区分析

目前国内外对鸡IL-10 的研究还很少，检测其含量动态变化还停留在mRNA 水平，还未见在蛋白水平上检测鸡IL-10 的报道。本研究获得的3 株杂交瘤细胞株(4B2，4F3，1E3)，产生的chIL-10 单抗识别chIL-10 不同的区域，并且都能识别真核表达的chIL-10，为制备chIL-10 的检测试剂盒奠定了基础，也为深入研究chIL-10 的生物学作用奠定了基础。

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Development and identification of monoclonal antibodies against chIL-10

GAO Jun-Feng ， LIU Ya-nan ， WANG Yong-qiang ， CAO Hong ， LI Xiao-qi ， ZHENG Shi-jun

(State Key Laboratory of Agrobiotechnology and College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China)

To develop monoclonal antibodies(McAbs)against chIL-10，chicken interleukin-10(mch-10)gene was cloned into a pET-30a vector，and the protein was expressed inE.coliand purified with affinity Chromatography.We immunized BALB/c mice with the purified protein，and fused murine splenocytes with SP2/0.An indirect ELISA using GST-mchIL-10 protein as coating antigen was established to screen positive clones. We obtained 3 hybridoma cell clones that stably secreted McAbs against chIL-10 and these clones were named 4B2，4F3 and 1E3，respectively.The titers in ascite fluid were 1:3.2×106.The dissociation constants(kDs)were 1.05×10-9，5.01×10-10，and 7.59×10-10，respectively.The isotypes of these McAbs were determined to be IgG2a，IgG2a and IgG1.These McAbs specifically bound to chIL-10 expressed by either prokaryotic or eukaryotic system as demonstrated by Western Blot.The binding domain of chIL-10 recognized by 4B2，4F3 was located between 1-52aa，and that by 4B2 was located between 52-102aa as determined by Western Blot.These McAbs would help to detect chIL-10 and to elucidate the biological roles of chIL-10 in immune responses.

chicken interleukin-10 ； prokaryotic expression ； monoclonal antibody

s:ZHENG Shi-jun ； LI Xiao-qi

2015-08-11

国家自然科学基金(31272543)；现代农业产业技术体系建设专项资金(NYCYTX-41)

高俊峰(1990-)，男，博士生，主要从事病原与宿主相互作用机制的研究，E-mail：jfgao@cau.edu.cn

郑世军，E-mail：sjzheng@cau.edu.cn；李晓齐，E-mail：leexiaoqi@cau.edu.cn

S852.4

A

0529-6005(2016)12-0003-04