血浆微小RNA-208a、210、506与急性心肌梗死的相关性

李胜男 李玉子

(延边大学附属医院，吉林 延吉 133000)

血浆微小RNA-208a、210、506与急性心肌梗死的相关性

李胜男 李玉子

(延边大学附属医院，吉林 延吉 133000)

目的探讨血浆微小RNA-208a、210、506在急性心肌梗死(AMI)早期诊断中的意义及其与AMI严重程度的相关性，并进一步探讨其在延边地区朝鲜族与汉族AMI患者间的表达差异。方法 将研究对象分为正常对照组和AMI组，AMI组又分为急诊手术亚组、择期手术亚组和Gensini评分四个亚组。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测血浆miR-208a、210、506相对表达量。结果 AMI组miR-208a、miR-506相对表达量较对照组升高(P<0.01，P<0.05)，miR-210较对照组降低(P<0.01)；急诊手术组miR-208a较择期手术组升高(P<0.05)。三种miRNAs在朝鲜族与汉族间无明显差异。MiR-208a与年龄、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)、pro-BNP呈显著正相关，miR-210与年龄、pro-BNP呈负相关，miR-506与低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、CK-MB、cTnI、pro-BNP呈正相关。Gensini评分与miR-208a、miR-506呈显著正相关，与miR-210呈显著负相关。结论 MiR-208、210、506可作为AMI的诊断标记物，其中miR-208可能为早期诊断AMI的生物标志物。miR-208a具有评价冠状动脉粥样硬化严重程度并进行危险分层的潜力。AMI患者血浆miR-208a、miR-210、miR-506的表达水平无地区、民族差异。

急性心肌梗死；微小RNA；诊断；生物标记

急性心肌梗死(AMI)是一类以心肌缺血缺氧及随之发生的心肌细胞损伤为主要病理生理变化的心脏病急症。除了典型胸痛、心电图及“金标准”冠脉造影等诊断手段外，传统的血液学检查〔肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)〕已占据重要地位。微小RNA(miR)是一类普遍存在于生物全血、血浆和血清中的小分子非编码RNA，参与血管内皮细胞的分化、增殖、凋亡，脂质代谢、氧化应激及动脉粥样硬化形成等，进而调控众多的生理和病理生理过程〔1〕。本研究通过检测血浆miR-208a、miR-210、miR-506的表达水平，探讨其在AMI早期诊断中的意义及其与AMI严重程度的相关性，同时对比其在延边地区朝鲜族与汉族AMI患者间的表达是否有差异。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2014年4～9月于延边大学附属医院心内科行冠状动脉造影检查及住院治疗的AMI患者50例(AMI组)，同期行健康检查的健康人群27例(对照组)。所有受试者以血常规、肾功、肝功等临床理化检查为依据，排除同时合并感染、严重肝肾功能不全、恶性肿瘤、近期脑血管病以及自身免疫性疾病等。AMI诊断标准参照2012版第3次心肌梗死全球定义。血清心肌酶学标志物(cTnI、CK-MB)升高(至少超过99%参考值上限)，并至少伴有以下一项临床指标：(1)心肌缺血症状；(2)缺血性心电图改变：ST-T改变或新发的左束支传导阻滞；(3)病理性Q波；(4)影像学改变：新的存活心肌丧失或节段性室壁运动障碍；(5)冠脉造影示冠状动脉主支或分支阻塞或持续性慢血流或无复流或栓塞。

1.2 分组 AMI组按民族分为朝鲜族亚组(20例)和汉族亚组(30例)；按冠脉造影检查时间分为急诊手术亚组(15例)和择期手术亚组(35例)。采用Gensini评分评价冠状动脉粥样硬化严重程度：每处病变的严重程度为病变血管解剖部位系数与其狭窄程度系数的乘积，每例患者冠状动脉粥样硬化严重程度为每处病变分数之和，最后按照评分分为：A组：积分<30(13例)；B组：30≤积分≤60(24例)；C组：积分>60(13例)。

1.3 方法

1.3.1 样本收集 每位受试者于入院后行冠脉造影检查当日抽取肘部静脉血约3 ml，室温下3 000 r/min离心15 min，取上清液至1.5 ml离心管中，-80℃冻存待用。

1.3.2 总RNA提取 取500 μl样本加1 ml TRIzol(Invitrogen，USA)及0.2 ml氯仿，室温强烈混匀，4℃ 、13 000 r/min离心15 min后提取最上层透明水相至新的1.5 ml离心管中；加0.5 ml异丙醇后再次同条件离心后可见离心管贴壁形成的白色沉淀即RNA。弃上清，加多于1 ml的现配70%乙醇，同条件离心后吸除乙醇；彻底干燥后加入15～30 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水；用超微量核酸定量仪检测浓度后-80℃ 冻存。

1.3.3 实时荧光定量聚合酶链(qRT-PCR)检测3种miRNAs 取每份RNA原液2 μl，加入特异性引物(上海诺伦公司)及MMLV逆转录酶等构建反应体系；在16℃、30 min，42℃、30 min，85℃、10 min反应环境中进行逆转录，miR-16设为标准内参。最后，每个样本设置3个反应管，使用实时荧光定量PCR仪(Agilent，Germany)在95℃、3 min，95℃、12 s，60°、40 s反应环境中经40个循环对目的cDNA产物进行qRT-PCR反应。

1.3.4 实验结果分析 将所采集的Ct值作为样本表达量标准，采用2-△△Ct法计算miRNAs的相对表达量。

1.3.5 CK-MB、cTnI检测 通过全自动生化分析仪(Toshiba，Japan)检测血浆CK-MB、cTnI值。

1.4 统计学方法 应用SPSS22.0及GraphPadPrism6软件，临床数据比较采用t检验、χ2检验、Spearman秩相关和受试者工作特征曲线(ROC)。

2 结 果

2.1 临床资料分析 AMI组与对照组相比，男性患者所占比例及高龄患者偏多，多有吸烟史，体重指数、TG、CK-MB及cTnI指标较高(P<0.05)；AMI组汉族体重指数、cTnI值较朝鲜族升高，但高血压频率较低(P<0.05)。

2.2 miR-208a、210、506相对表达量比较 AMI组miR-208a(7.98±10.19)、miR-506(1.53±1.12)高于对照组(1.02±0.61，0.60±0.52)，miR-210(0.50±0.31)低于对照组(1.28±1.23)；急诊手术组miR-208a(9.34±16.10)较择期手术组(4.66±5.56)升高，miR-210(0.59±0.26 vs 0.56±0.36)、506(1.71±1.16 vs 1.46±1.08)在两组间无明显差异。三种miRNAs相对表达水平在朝鲜族与汉族间无明显差异。

2.3 miR-208a、210、506与冠状动脉粥样硬化严重程度的关系 对照组及Gensini评分的三个亚组的miR-208a相对表达量分别为：对照组1.00±0.61、A组3.73±2.27、B组9.74±13.33、C组9.24±6.89，A、B、C三组均较对照组升高，其中B、C组较A组升高(均P<0.05)，但B组与C组无明显差异；四组miR-210相对表达量分别是：1.25±1.22、0.59±0.34、0.52±0.34、0.39±0.22，A、B、C组均较对照组降低，在三组间两两比较均无统计学差异；四组miR-506相对表达量分别是：0.64±0.54、1.17±1.02、1.39±0.99、1.63±1.49，A、B、C组较对照组升高，但三组间两两比较均无统计学差异。

2.4 三种miRNAs诊断AMI的敏感性比较 绘制受试者工作特征曲线(ROC)miR-208a、miR-210、miR-506、CK-MB及cTnI曲线下面积分别为0.917(95%CI：0.856～0.979)、0.753(95%CI：0.624～0.882)、0.807(95%CI：0.699～0.915)、0.758(95%CI：0.653～0.864)、0.750(95%CI：0.644～0.856)。由图1所示，miR-208a、miR-210、miR-506具有早期诊断AMI的能力，但并不优于CK-MB和cTnI。

A：1.miR-208a；2.CK-MB；3.cTnI；4.miR-506；B：1.miR-210图1 ROC分析

3 讨 论

本研究中miR-208a在AMI患者血浆中高表达，其相对含量较对照组显著升高，此发现与Wang等〔2〕及Oerlemans等〔3〕的研究结果一致，提示miR-208a可作为诊断AMI的新型生物标志物。Ji等〔4〕通过基因芯片技术检测得出小鼠miR-208只在心肌表达的高组织特异性，且在诱导心肌损伤3 h后逐渐升高，持续12 h后逐渐恢复基础水平。而这种组织特异性还表现在其他组织器官的低表达，肾脏特异的miR-10a在发生肾梗死时增高，而此时miR-208的水平却变化不明显。心肌坏死后miR-208表达升高，含量稳定，且与心肌梗死面积呈正相关。李祥云等〔5〕的研究对miR-208与CK-MB、cTnI相比较分析发现，miR-208不仅对AMI早期诊断具有参考价值，而且还具有一定的时间效应，不仅发病1 h即可检测到其值升高，且具有相对更宽泛的检测窗口期。本研究血浆miR-208a表达水平较CK-MB和cTnI开始升高的时间更早，由此可以推测miR-208a具有早期诊断AMI的潜力。

miR-210的表达受缺氧诱导，调控相关基因表达，近年来在包括缺血性损伤及肿瘤在内的多种疾病诊治中成为新的靶点〔6〕。Zhao等〔6〕的研究发现心力衰竭患者血浆miR-210表达水平升高，且趋于胎儿水平。除了在心脏疾病的异常表达外，miR-210也影响急性脑缺血性损伤的发生发展机制，但与心力衰竭不同，急性脑梗死患者血清中miR-210表达减弱，且与急性脑梗死严重程度有关，可作为急性脑梗死的诊断依据〔7，8〕。急性脑梗死与AMI两者发病机制相似。有研究〔9〕证实miR-210与低氧诱导因子(HIF)-1α在缺氧诱导环境中表达增高，且协同提高，具有心肌梗死的治疗潜力。Wang等〔10〕认为AMI相关基因的表达异常可能归于其各自的调节miRNA表达异常，抑制miR-210的表达能够提高AMI模型大鼠的生存率和心脏功能。由上可以看出miR-210不仅具有诊断AMI的潜力，更有望成为AMI临床治疗中的新靶点。

研究表明，实体肿瘤细胞因其生长特性实际上是处于一种相对乏氧的状态〔11〕，无论是肿瘤细胞还是缺血的心肌细胞内，HIF-1α高表达〔12〕也进一步推测两者具有理化性质相似的内环境。本研究结果显示AMI组miR-506表达水平高于对照组，提示miR-506有可能作为AMI诊断的新型生物标记物。本研究也发现民族差异不影响血清三种miR表达量变化，是否罹患AMI与民族差异无明显关系。

1 Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function〔J〕.Cell，2004；116(2)：281-97.

2 Wang GK，Zhu JQ，Zhang JT，etal.Circulating microRNA：a novel potental biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans〔J〕.Eur Heat J，2010；31(6)：659-66.

3 Oerlemans MI，Mosterd A，Dekker MS，etal.Early asessment of acute corona ry syndromes in the emergency department：the potential diagnostic value of circulating microRNAs〔J〕.EMBO Mol Med，2012；4(11)：1176-85.

4 Ji X，Takahashi R，Hiura Y，etal.Plasma miR-208 as abiomarker of myocardial in jury〔J〕.Clin Chem，2009；55(11)：1944-9.

5 李祥云，蔡成松，潘 峰，等.microRNA-208在急性心肌梗死病人血清中的变化〔J〕.医学研究杂志，2013；42(6)：62-5.

6 Zhao DS，Chen Y，Jiang H，etal.Serum miR-210 and miR-30aexpression stend to revert to fetal levels in Chinese adult patients with chronic heart failure〔J〕.Cardiovasc Pathol，2013;22(6)：444-50.

7 吴 皎，姜 新，陈晓红.急性脑梗死患者miR-210的表达及意义〔J〕.中国实用神经疾病杂志，2016；19(3)：3-5.

8 史孟婧，赵远鹏，邹仲敏，等.MiR-210在缺氧中调控机制的研究进展〔J〕.现代生物医学进展，2013；13(16)：3173-5.

9 Chang W，Lee CY，Park JH，etal.Survival of hypoxic human mesenchymal stem cells is enhanced by apositive feedback loop involving miR-210 and hy poxia-inducible factor1〔J〕.J Vet Sci，2013；14(1)：69-76.

10 Wang Y，Pan X，Fan Y，etal.Dysregulated expression of microRNAs and mRNAs in myocardia linfarction〔J〕.Am J Transl Res，2015；7(11)：2291-304.

11 Luoto KR，Kumareswaran R，Bristow RG.Tumorhy poxiaasa driving for ceingene ticins tability〔J〕.Genome Int，2013；4(1)：5.

12 Semenza GL.Hypoxia-inducible factor1 and cardiovascular disease〔J〕.Ann Rev Physiol，2014；76(1)：39-56.

〔2015-12-29修回〕

(编辑 袁左鸣)

吉林省科技发展计划项目(No.20140414065GH)

李玉子(1965-)，女，博士，硕士生导师，主任医师，主要从事冠心病研究。

李胜男(1990-)，女，硕士，主要从事冠心病研究。

R541.4

A

1005-9202(2016)24-6112-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.031