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老年糖尿病肾病患者转化生长因子β1基因表达调控区甲基化改变及机制

2016-02-06王海萍

中国老年学杂志 2016年24期
关键词:外显子甲基化肾病

金 琳 王海萍

(山东大学附属省立医院内科及心血管中心,山东 济南 250000)

老年糖尿病肾病患者转化生长因子β1基因表达调控区甲基化改变及机制

金 琳 王海萍

(山东大学附属省立医院内科及心血管中心,山东 济南 250000)

目的观察老年糖尿病肾病患者转化生长因子(TGF)β1基因表达调控区甲基化改变情况,探讨甲基化在糖尿病肾病发病机制中的作用。方法 老年2型糖尿病患者182例,分为单纯糖尿病组84例、糖尿病肾病组98例,选取同期体检的老年健康志愿者60名为健康对照组。提取3组外周血基因组DNA,进行亚硫酸氢盐修饰处理。采用甲基化特异性PCR技术初筛3组TGF-β1基因表达调控区DNA甲基化人群,用亚硫酸氢盐修饰后测序技术检测3组TGF-β1基因表达调控区DNA甲基化水平。ELISA法检测3组血清TGF-β1蛋白表达水平;分析糖尿病肾病组TGF-β1蛋白表达相关影响因素。结果 单纯糖尿病组和糖尿病肾病组TGF-β1基因第一外显子区甲基化比例均明显低于健康对照组(P<0.05),糖尿病肾病组与单纯糖尿病组相比进一步降低。单纯糖尿病组甲基化水平明显低于健康对照组(P<0.05);糖尿病肾病甲基化水平明显低于健康对照组和单纯糖尿病组(P<0.05)。单纯糖尿病组和糖尿病肾病组TGF-β1蛋白水平均明显高于健康对照组(P<0.05);糖尿病肾病组与单纯糖尿病组相比进一步升高。血清TGF-β1蛋白表达水平与UACR、BUN、Scr、FBS、PBS呈明显正相关,与eGFR、基因甲基化呈明显负相关。进一步多元逐步回归分析显示,eGFR和基因甲基化与血清TGF-β1蛋白表达水平存在明显相关性,是影响TGF-β1表达的因素。血清TGF-β1蛋白表达水平与病理分级呈明显正相关;糖尿病肾病组12个CpG位点甲基化含量与病理分级相关。结论 TGF-β1基因表达调控区甲基化是高糖诱导系膜细胞 TGF-β1基因表达激活的重要机制,参与老年糖尿病肾病的发生与发展。

糖尿病肾病;DNA甲基化;转化生长因子β1

糖尿病肾病是糖尿病最常见的微血管并发症,是终末期肾病的主要原因之一〔1〕。研究显示,糖尿病肾病发生率与患者年龄和糖尿病持续时间呈正相关〔2〕。转化生子因子(TGF)-β1是介导糖尿病肾病肾小球硬化的主要细胞因子,TGF-β1基因激活是糖尿病肾病早期系膜细胞转分化的关键。研究发现,表观遗传学改变可能是糖尿病肾病发生、发展过程中环境与遗传因素相互作用的桥梁,特别是基因表达调控区DNA甲基化可能参与病情的发生发展过程〔3〕。本研究使用甲基化特异性PCR技术(MSP)和亚硫酸氢盐修饰后测序技术(BSP)检测TGF-β1基因表达调控区DNA甲基化情况,旨在阐明甲基化变化在糖尿病肾病发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月至2015年12月本院收治的2型糖尿病老年患者182例。根据UACR水平分为单纯糖尿病组(UACR<30 μg/mg)84例和糖尿病肾病组(UACR>30 μg/mg)98例,选取同期在本院体检的老年健康志愿者60例为健康对照组。单纯糖尿病组中男40例,女44例;年龄60~78岁,平均(67.82±8.50)岁;空腹血糖(FPG)(6.39±0.95)mmol/L。糖尿病肾病组中男48例,女50例;年龄60~76岁,平均(66.51±9.37)岁;FPG(6.77±1.05)mmol/L。健康对照组中男26例,女34例;年龄60~75岁,平均(64.95±11.60)岁。三组性别构成、年龄无统计学差异(P>0.05);单纯糖尿病组与糖尿病肾病组患者FPG差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 基因组DNA提取及亚硫酸氢钠修饰 收集受试者空腹肘静脉血2 ml,使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(普洛麦格生物技术有限公司)提取外周血白细胞DNA,分光光度法检测DNA纯度,-80℃保存。使用亚硫酸氢盐转化试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)进行DNA亚硫酸氢钠修饰处理,未甲基化的胞嘧啶经修饰后变为尿嘧啶,甲基化的胞嘧啶则不发生改变。

1.3 MSP初筛各组TGF-β1基因表达调控区甲基化人群 使用ABI Primer Express 2软件预测TGF-β1基因表达调控区CpG富含区域,寻找跨越启动子和第一外显子区的CpG富含区域,见图1。使用该软件设计MSP甲基化和非甲基化TGF-β1引物,引物区段为CpG最大富含区,位于第一外显子区,引物合成由金斯瑞生物科技有限公司完成。PCR反应体系20 μl,包含经修饰后的DNA模板1 μl,含Mg2+的PCR缓冲液5 μl,上、下游引物各1 μl,dNTP 1 μl,Taq DNA聚合酶1 μl,蒸馏水10 μl。常规PCR反应条件下扩增40个循环,取10 μl产物行琼脂糖凝胶电泳,成像系统扫描成像。同一DNA分别用甲基化TGF-β1引物和非甲基化TGF-β1引物行PCR。

1.4 BSP检测TGF-β1基因表达调控区甲基化水平 使用ABI Primer Express 2软件以TGF-β1表达调控区CpG富含区域为靶向序列设计引物,扩增TGF-β1基因215~208序列,包括启动子和第1外显子序列,第1外显子启始位点为1,共424 bp,见图1。PCR反应体系50 μl,其中经修饰后的DNA模板1 μl,含Mg2+的PCR缓冲液5 μl,上、下游引物各1 μl,dNTP 1 μl,Taq DNA聚合酶1 μl,蒸馏水40 μl。常规PCR反应条件下扩增42个循环。扩增产物经电泳后紫外灯下观察目的片段,取10 μl送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。使用MUMmer软件比对基因序列。

图1 假定全部CG均甲基化经亚硫酸氢钠修饰后的TGF-β1基因-215~208序列

1.5 血清TGF-β1蛋白检测及糖尿病肾病病理分级 采用ELISA试剂盒检测血清TGF-β1蛋白水平。根据肾小球病变程度,结合肾小管间质和血管病变进行分级:1级:单纯肾小球基底膜增厚;2级:系膜轻度增生或肾小球硬化程度小于25%,无结节性硬化;3级:系膜重度增生或肾小球硬化程度25%~50%,无结节性硬化;4级:无结节性硬化或肾小球硬化程度51%~75%;若存在肾小管间质病变或血管病变则加1级。

1.6 统计学分析 采用SPSS15.0软件,计量资料行t检验,计数资料进行χ2检验,进行Pearson检验和多元逐步回归分析。

2 结 果

2.1 MSP检测各组TGF-β1基因表达调控区甲基化状态 健康对照组60例受试者中44例(73.33%)TGF-β1基因第一外显子区甲基化;单纯糖尿病组84例患者中36例(42.86%)呈甲基化;糖尿病肾病组98例患者中12例(12.24%)呈甲基化。单纯糖尿病组和糖尿病肾病组TGF-β1基因第一外显子区甲基化比例均明显低于健康对照组(P<0.05);糖尿病肾病组与单纯糖尿病组相比进一步降低(P<0.05)。

2.2 BSP检测TGF-β1基因表达调控区甲基化程度 3组样本BSP引物扩增产物测序TGF-β1基因甲基化改变集中在第59~189位点之间,共12个CpG位点。健康对照组甲基化水平为(67.81±10.25)%;单纯糖尿病组为(36.74±7.18)%,明显低于健康对照组(P<0.05);糖尿病肾病组为(13.63±8.28)%,明显低于健康对照组和单纯糖尿病组(P<0.05)。见图2。

2.3 各组血清TGF-β1蛋白水平 健康对照组血清TGF-β1蛋白水平为(285.27±63.26)ng/L,单纯糖尿病组为(1 351.18±115.02)ng/L,糖尿病肾病组为(2 874.62±380.25)ng/L;单纯糖尿病组和糖尿病肾病组均明显高于健康对照组(P<0.05);糖尿病肾病组与单纯糖尿病组相比进一步升高(P<0.05)。

2.4 糖尿病肾病组TGF-β1表达相关因素分析 血清TGF-β1蛋白表达水平与UACR、BUN、Scr、FBS、PBS呈明显正相关(r=0.729、0.583、0.761、0.953、0.697,P均<0.01);与eGFR、基因甲基化呈明显负相关(r=-0.816、-0.931,P均<0.01)。将上述有相关性的因素作为自变量进一步行多元逐步回归分析,结果显示,eGFR和基因甲基化与血清TGF-β1蛋白表达水平存在明显相关性。见表1。

2.5 糖尿病肾病患者病理分级相关因素分析 血清TGF-β1蛋白表达水平与病理分级呈明显正相关(r=0.958,P<0.01);列联表分析显示,糖尿病肾病组12个CpG位点甲基化含量与病理分级相关(χ2=24.775,P<0.05)。见表2。

图2 TGF-β1第一外显子区甲基化水平(亚硫酸氢盐修饰后测序)

表1 血清TGF-β1表达水平影响因素的多元逐步回归分析

表2 各级糖尿病肾病患者甲基化含量分布(n)

病理分级12个CpG位点甲基化含量比例4/123/122/121/120合计1级46000102级26600143级4108140364级0012141238合计102226281298

3 讨 论

动物模型研究显示,肾小球系膜细胞表型转化为糖尿病肾病发病早期的主要表现,系膜细胞增殖、胞外基质大量合成和聚积可诱发糖尿病肾病的主要病理特征,即肾小球硬化〔4〕,在此过程中,TGF-β1基因表达激活是高糖诱导系膜细胞转分化的重要信号。本次研究显示,糖尿病肾病患者血清TGF-β1蛋白水平明显高于单纯糖尿病患者和健康人;相关性分析也发现,血清TGF-β1蛋白水平与糖尿病肾病患者病理改变严重程度呈正相关,进一步证明了TGF-β1参与了糖尿病肾病的发病机制。高糖诱导TGF-β1基因表达激活的分子机制目前仍未明确。相关研究显示,表观遗传学修饰,特别是表达调控区的DNA甲基化,在染色体活性丧失、基因组印迹、基因调控和稳定性方面发挥重要作用〔5〕。相关检测发现,糖尿病肾病患者体内CTGF基因启动子区甲基化水平低于健康对照组,而CTGF是一种分布广泛的致纤维化生子因子,与糖尿病肾病肾小球硬化之间存在相关性,说明DNA低甲基化可能参与高糖激活分子基因表达上调的机制〔6〕。DNA甲基化多在CpG富含区域的胞嘧啶上,多定位在启动子和第一外显子区。本次研究先用MSP法大体检测研究对象该区域甲基化情况,结果显示糖尿病肾病组甲基化比例最低,进一步采用BSP测序显示,甲基化修饰多发生在TGF-β1第一外显子区,证实了糖尿病肾病组和单纯糖尿病患者TGF-β1第一外显子区甲基化水平明显低于健康对照组,且糖尿病肾病患者TGF-β1甲基化水平与血清TGF-β1蛋白水平呈明显负相关,提示糖尿病肾病患者TGF-β1基因DNA去甲基化与TGF-β1基因表达激活相关。

表达程度高的基因其甲基化程度越低,该关系也体现在基因第一外显子CpG富含区域〔7〕,说明该区域DNA去甲基化可促进表达,该结论与本次研究发现一致。本研究发现了糖尿病肾病患者TGF-β1基因表达调控区去甲基化是高糖诱导TGF-β1基因表达激活的机制之一,低甲基化的TGF-β1基因可提升血清TGF-β1蛋白表达量,进而参与糖尿病肾病的发生发展。

1 李锦华.糖皮质激素治疗血小板减少并发类固醇糖尿病临床研究〔J〕.北华大学学报(自然科学版),2016;17(4):520-3.

2 张 超,胡 昭,董 帅,等.终末期肾病维持性血液透析患者生存率和死亡的影响因素〔J〕.中国老年学杂志,2014;34(5):1241-3.

3 Romagnani P,Remuzzi G.Renal progenitors in non-diabetic and diabetic nephropathies〔J〕.Trends Endocrinol Metab,2013;24(1):13-20.

4 Cherney DZI,Perkins BA,Soleymanlou N,etal.Renal hemodynamic effect of sodium-glucose cotransporter 2 inhibition in patients with type 1 diabetes mellitus〔J〕.Circulation,2014;129(5):587-97.

5 Katherine KJ,Liu YL,Zhang JZ,etal.Renal C3 complement component:feed forward to diabetic kidney disease〔J〕.Am J Nephrol,2015;41(1):48-56.

6 Zeng R,Duan L,Sun LN,etal.A meta-analysis on the relationship of eNOS 4b/a polymorphism and diabetic nephropathy susceptibility〔J〕.Renal Fail,2014;36(10):1520-35.

7 Rosenberg AZ,Naicker S,Winkler CA,etal.HIV-associated nephropathies:epidemiology,pathology,mechanisms and treatment〔J〕.Nat Rev Nephrol,2015;11(3):150-60.

〔2016-08-16修回〕

(编辑 郭 菁)

Changes of methylation and mechanism of expression of transforming growth factorβ1 gene in elderly patients with diabetic nephropathy

JIN Lin, WANG Hai-Ping.

Department of Internal Medicine,Provincial Hospital Affiliated to Shandong University,Jinan 250000,Shandong, China

Objective To observe the changes of methylation status in the regulation of transforming growth factor β1 gene expression in elderly patients with diabetic nephropathy (DN), and explore the role of methylation in the pathogenesis of DN. Methods 182 cases of elderly patients with type 2 diabetes were selected and divided into diabetes (DM) group with 84 cases and DN group with 98 cases. 60 healthy elderly healthy volunteers were selected into control group. Genomic DNA from peripheral blood of the study object was extracted and modified by hydrogen sulfate. Methylation specific PCR technique was used to detect the expression of TGF-β1 gene, and the DNA methylation level was detected by the sequencing technology after the modification of the TGF-β1 gene. ELISA method was used to detect the expression level of TGF-β1 protein. The correlation between the expression of TGF-β1 protein and the pathological grade was analyzed.Results TGFβ1 gene and significant promoter region methylation ratio in DM group and DN group were significantly lower than those of control group (P<0.05); Compared with DM group, DN group had further reduce. Methylation level of DM group was significantly lower than that in control group (P<0.05); Methylation level of DN group was significantly lower than that in control group and DM group (P<0.05). The protein levels of TGF-β1 in DM group and DN group were significantly higher than those in control group (P<0.05). protein levels of TGF-β1 of DN group was higher than that of DM group (P<0.05).The level of serum TGF-β1 protein was significantly positively correlated with UACR,BUN,Scr,FBS,PBS,and eGFR,gene methylation was significantly negatively correlated. Multiple stepwise regression analysis showed that there was a significant correlation between eGFR and gene methylation and the expression level of TGF-1 protein in serum,which was the influence factor of TGF-β1 expression. The expression level of serum TGF-β1 protein was significantly positively correlated with the pathological grading, and the methylation levels of the 12 CpG sites in the DN group were related to the pathological grading. Conclusions The methylation of TGF-β1 gene expression regulation region is an important mechanism of high glucose induced TGF-β1 gene expression in mesangial cells, which is involved in the occurrence and development of diabetic nephropathy in the elderly.

Diabetic nephropathy;DNA methylation;Transforming growth factor beta 1

国家自然科学基金项目(81200530)

王海萍(1981-),女,副主任医师,主要从事肾脏病基础与临床研究。

金 琳(1972-),女,主管护师,主要从事心血管内科基础及临床研究。

R587

A

1005-9202(2016)24-6133-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.041

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