紫花苜蓿根腐新病原-厚垣镰孢菌生物学特性研究

柏玉晶，张贞明，姚玉玲，薛 莉，张振粉，杨成德

(1.甘肃农业大学植物保护学院 ，甘肃 兰州 730070； 2.甘肃省草原技术推广总站， 甘肃 兰州 730010；3.甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

紫花苜蓿根腐新病原-厚垣镰孢菌生物学特性研究

柏玉晶1，张贞明2，姚玉玲1，薛 莉1，张振粉3，杨成德1

(1.甘肃农业大学植物保护学院 ，甘肃 兰州 730070； 2.甘肃省草原技术推广总站， 甘肃 兰州 730010；3.甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

针对紫花苜蓿根腐致病菌厚垣镰孢菌(Fusariumchlamydosporum)在不同温度、光照、pH和多种碳氮源条件下的生物学特性，采用菌饼法进行了测定，并对不同碳氮源下菌落产色素情况进行了连续观察。结果表明：该病原菌在5～40℃均可生长，最适温度为25℃；当pH 4.0～12.0时均能生长，最适宜pH为7.0；全黑暗条件有利于菌丝生长，菌丝生长最适碳源、氮源分别为山梨醇和蛋白胨，碳源氯醛糖及除蛋白胨以外8种氮源均不利于菌丝的生长。含不同碳氮源培养基可诱导菌丝产生不同色素，且颜色变化差异大，在不同的生长阶段，色素颜色也会发生变化。

苜蓿根腐病；厚垣镰刀菌；生物特性；色素

紫花苜蓿(Medicagosativa)耐干旱贫瘠，再生性强，产草量高，粗蛋白含量高，素有牧草之王的称号，是畜牧业首选青饲料，在世界各国广泛种植。近几年，随着我国草地畜牧业的发展和农业产业结构的调整，苜蓿种植面积逐步扩大，已居世界第6位。但是由于我国苜蓿品种单一和利用年限的增长，尤其是苜蓿根腐病发生日趋严重，已严重威胁到苜蓿产业的可持续发展[1]。据报道，苜蓿根腐病在美国、加拿大、澳大利亚、俄罗斯、日本和阿根廷等国家[2-7]及国内新疆、甘肃、青海和内蒙古等地严重发生[8-11]，全世界每年造成的产量损失在20%，严重发生的地块达到40%[12]，使苜蓿固氮能力降低，植株衰弱，单产和品质下降。国内外先后报道的苜蓿根腐病病原菌中镰孢菌达14种，国内报道有尖孢镰孢(F.oxysporum)、锐顶镰孢(F.acuminatum)、半裸镰孢(F.semitectum)、茄镰孢(F.solani)、串珠镰孢(F.moniliforme)和拟枝孢镰孢菌(F.sporotrichioide)[8,13-14]。从试验前期研究发现，从甘肃省苜蓿根腐病样分离获得的厚垣镰孢菌(F.chlamydosporum)经致病性测定发病率达75%，可引发苜蓿根腐病，据报道该病原菌还可引起多种植物病害[15-18]。因此，为了有效防控由病菌引起的苜蓿根腐病，试验对厚垣镰孢菌的生物学特性开展了研究，并对碳氮源利用能力及产色素情况进行观察，以期为明确该病害的发生规律及防控措施的制定提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试菌种

供试菌株厚垣镰刀菌由植物病理实验室提供。

1.2 温度对菌丝体生长的影响

菌株25℃恒温培养5 d，用直径5 mm的打孔器于菌落边缘打取菌饼接于PDA平板中央，分别置于0～45℃(间隔5℃)恒温培养箱中培养，3次重复，第5 d用十字交叉法测量菌落直径，利用SSPSS 19.0软件和Excel进行数据统计和分析。

1.3 光照对菌丝体生长的影响

设24 h/d连续光照、12 h光照12 h黑暗光暗交替和24 h/d全黑暗3个处理，将5 mm的菌饼接种于PDA平板中央，最适温度下培养，3次重复，其他方法同1.2。

1.4 pH对菌丝体生长的影响

用0.1%的HCl和0.1%的NaOH将PDA培养基pH调节至4.0～12.0(间隔1.0)，最适温度下培养，3次重复，其他方法同1.2。

1.5 碳、氮源对病原菌生长的影响

基础培养基：KH2PO40.5 g、K2HPO40.6g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.1 g、CaCl20.1g、水1 000 mL和琼脂12 g。

1.5.1 碳源对病原菌生长的影响 基础培养基加入0.5%蛋白胨，再分别加入葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、氯醛糖、2%可溶淀粉9种碳源，配制含不同碳源的固体培养基，以无碳源为对照，最适温度下培养，3次重复，其他方法同1.2，并拍照。

1.5.2 氮源对菌丝体生长的影响 基础培养基加入葡萄糖(2%)，再分别加入天门冬酰胺、甘氨酸、L -酪氨酸、蛋白胨、尿素、KNO3、NH4NO3、NH4Cl、0.5%NH4H2PO49种氮源，配置含不同氮源的固体培养基，以不含氮源为对照，最适温度下培养，3次重复，其他方法同1.2。

1.5.3 不同碳氮源培养对菌落产色素的影响 连续观察不同碳氮源培养条件下菌落产色素情况及色素变化状况。

2 结果与分析

2.1 温度对菌丝体生长的影响

菌株在5～40℃均可生长，0～25℃菌丝生长速率随温度的升高显著升高，30～40℃显著下降(P<0.05)，其中，在25℃时菌落直径可达8.03 cm，显著高于其他温度条件，为最适生长温度；0℃和45℃菌丝不生长(图1)。

图1 温度处理下病原菌菌丝的生长状况Fig.1 Effect of tempreture on mycelium growth

2.2 光照对菌丝体生长的影响

全黑暗条件下菌丝生长最快，培养5 d菌落直径可达7.07 cm，显著高于全光照和光暗交替条件(P<0.05)，表明黑暗有利于菌丝生长，光照对病原菌菌丝的生长有一定的抑制作用(图2)。

图2 光照处理下病原菌菌丝的生长状况Fig.2 Effect of illumination on mycelium growth

2.3 pH对菌丝体生长的影响

菌丝在pH 4.0～12.0均可生长，pH为7.0时菌丝生长最快，菌落直径可达7.70 cm，在pH 6.0～9.0菌丝生长速率差异不显著(图3)。

图3 pH处理下病原菌菌丝的生长状况Fig.3 Effect of PH on mycelium growth

2.4 碳、氮源对病原菌生长的影响

2.4.1 碳源对菌丝体生长的影响 菌丝均生长较快，在第5 d时菌丝长满培养皿，其中，以山梨醇为碳源的培养基上菌丝生长最快，菌落直径达8.42 cm，其次为甘露醇和麦芽糖，菌落直径分别为8.28和8.23 cm；D-木糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖培养基菌落直径均明显大于对照，但可溶性淀粉和氯醛糖对菌丝生长有抑制作用，其中氯醛糖显著低于其他碳源，且菌丝稀薄，近透明；在含不同碳源培养基上菌落均为圆形，D-木糖、葡萄糖和蔗糖培养基菌落边缘不整齐。试验结果表明，山梨醇是F.Chlamydosporum生长的最佳碳源，氯醛糖对菌丝生长有明显的抑制作用(表1)。

表1 碳氮源处理下菌丝的生长
Fig.1 Effect of C-source and N-source on the mycelial ofFusariumchlamydosporum

碳源菌落直径/cm氮源菌落直径/cm山梨醇8．42a蛋白胨7．82a甘露醇8．28abCK6．63b麦芽糖8．23b硝酸钾6．28cD⁃木糖7．93c甘氨酸5．45d葡萄糖7．82cL⁃酪氨酸4．97e蔗糖7．67d天门冬氨酸4．87e乳糖7．6d硝酸铵4．37fCK7．27e尿素3．67g可溶性淀粉7．25e氯化铵2．5k氯醛糖2．58f磷酸二氢铵2．38k

2.4.2 氮源对菌丝体生长的影响 在以蛋白胨为氮源的培养基上，菌落直径达7.82 cm，与对照差异显著(P<0.05)，有显著的促进作用，硝酸钾、甘氨酸、L-酪氨酸、天门冬氨酸、硝酸铵、尿素、氯化铵和磷酸二氢氨均对该菌的生长有显著抑制作用(P<0.05)，其中磷酸二氢氨对菌丝生长抑制能力最强(表1)。在含不同氮源培养基上培养5 d后，对照菌落圆形，菌丝白色、绒毛状、稀疏；尿素培养基菌落圆形，气生菌丝致密；蛋白胨、硝酸钾、甘氨酸、L-酪氨酸和天门冬氨酸培养基菌落近圆形，边缘不整齐，硝酸铵、氯化铵和磷酸二氢氨培养基菌落不规则。试验结果表明，F.Chlamydosporum生长的最佳氮源为蛋白胨这种有机氮，其次硝态氮和铵态氮，且多数硝态氮和铵态氮都不利于该菌生长。

2.4.3 不同碳氮源培养对菌落产色素的影响 甘露醇、麦芽糖、D-木糖、葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉均可促使菌落产生橘黄至橘红色色素，其中葡萄糖和蔗糖色素产量最大，随着培养时间的增长培养基背面整体变为棕红色，菌丝也由白色变为淡棕红色，并产生大量棕红色颗粒状子实体；山梨醇培养基由淡紫红色逐渐变为紫色至紫黑色；对照无色素产生(图4)。

蛋白胨、甘氨酸、L-酪氨酸、天门冬氨酸和硝酸铵培养基均能产生橘黄色色素，随着时间的增长色素颜色加深，直至培养基背面全部变色，其中相同时间段内蛋白胨产色素最多，由橘黄色变为橘红色；氯化铵和磷酸二氢铵虽然菌丝生长缓慢，但是培养基背面完全为橘红色；硝酸钾培养基产生黄绿色色素，后期培养基背面逐渐全部变为黄绿色、绿色至黑绿色(图5)。

试验结果说明，含不同碳氮源培养基可诱导菌丝产生不同色素，且颜色变化差异大；在不同的生长阶段，色素颜色亦会发生变化，因此，生产上可以根据需求，对不同阶段的色素进行研究利用。

图4 不同碳源培养下菌落产色素状况Fig.4 The pigmeng production of Fusarium Chlamydosporum in different C-source注：a.山梨醇;b.甘露醇;c.麦芽糖;d.D-木糖;e.葡萄糖;f.蔗糖;g.乳糖;h.CK;i.可溶性淀粉;j.氯醛糖

3 讨论

苜蓿根腐病是一种典型的土传病害，病原种类较多，国内外先后报道的该病病原已达29种，但主要由镰孢菌属真菌引起。其病原菌对植物体的侵染一方面取决于其自身结构功能和产生的多种次生代谢产物对植株的影响，如真菌菌丝可穿透植物表皮细胞进入植物体，Rocha等从玉米上分离的轮枝镰孢菌代谢产生的伏马菌素、AAL毒素具有很强的毒性，能杀死植物细胞核；另一方面也决定于温度、光照、pH等环境因素的变化，适宜的环境因素能促进真菌菌丝生长，菌核萌发，进而侵染植物体，使植株发病。因此，病原菌生物学特性的研究是掌握其发病规律的基础，本试验对不同温度、光照、pH、碳、氮源下苜蓿根腐病病原菌-厚垣镰刀菌菌丝的生长进行了研究，结果表明：该菌在温度5～40℃和pH 4.0～12.0均可生长，在过酸过碱条件下菌丝体仍生长良好，菌丝发达而致密，说明厚垣镰孢菌对环境有较强的适应性，可耐高温和酸碱，因而只要条件适宜，其可在苜蓿的各个生育期进行侵染；在黑暗条件下菌丝生长最快，而土壤的不透光性正为其生长提供了有利条件。碳源为真菌生长提供了碳素，其氧化过程也为真菌基本生命活动提供了能源，该病原菌喜好山梨醇和甘露醇而较少利用多数真菌喜欢的葡萄糖、蔗糖等糖类，其可能是因为菌丝的生长受到了环境因素的诱导而产生了能分解醇类的酶，该酶在分解醇类过程中可释放更多的能量供菌丝生长[17-18]。在氮源的利用上，该菌能更好的利用蛋白胨这种有机氮，对硝态氮的利用率低，极不喜好铵态氮，而铵是参与菌株生长代谢的直接底物，多数真菌优先利用铵态氮作为氮素营养[19]，潘红等[20]研究报道尖孢镰刀菌对氮素的有效利用顺序为：铵态氮>有机氮>硝态氮，因此，铵态氮为什么能制约厚垣镰孢菌菌丝生长有待研究，有报道施氮40 kg/hm2苜蓿干草产量会显著升高。

图5 不同碳源培养下菌落产色素Fig.5 The pigmeng production of Fusarium Chlamydosporum in different N-source注：a.蛋白胨;b.CK;c.硝酸钾;d.甘氨酸;e.L-酪氨酸;f.天门冬氨酸;g.硝酸铵;h.尿素;i.氯化铵;j.磷酸二氢铵

色素广泛应用于食品、医药、化妆品等多种工业领域[21]，近年来，随着人民生活理念的转变，人们开始注重色素的品质，天然色素的开发和应用有了较大发展。张银[22]发现，丝状真菌中存在大量可食用色素，王风琴等[23]从一株南极真菌中分离得到一种色素，并做了小鼠的毒力测定，确定该色素为可食用色素。真菌色素与其致病力和真菌耐药性有密切关系，有增强致病真菌侵袭毒力和诱生真菌耐药性的双重作用，侯幼红等[24]报道真菌色素与其菌株的生理代谢和致病性密切相关，是致病性真菌主要的致病毒力因子之一。

4 结论

(1)试验明确了不同环境因素对菌丝的生长的影响，为苜蓿根腐病的准确预报和合理防治提供理论依据，但有关不同环境因素对厚垣镰孢菌产孢的影响及苜蓿根腐病的田间防治方法等需在今后做进一步研究。

(2)对不同碳氮源条件下菌株的产色素情况进行了初步观察，结果表明不同碳氮源和不同的培养时间均可促使该病原菌产生不同色素，但为确定不同色素是否与菌株生理代谢和致病性有关，是否能用于食品、医药等领域，还需对色素种类、产量、产生原因及功能等做进一步研究。

[1] 刘海波,玉永雄.紫花苜蓿根腐病研究进展[J].草原与草坪,2006(3):3-6.

[2] 袁庆华.我国苜蓿病害研究进展[J].植物保护,2007,33(1):6-10.

[3] 杨红善,常根柱,周学辉,等.美国引进苜蓿品种半湿润区栽培试验[J].草业学报,2010,19(1):121-127.

[4] Uddin W,Knous T R.Fusarium species associated with crown rot of aifalfa in Nevada[J].Plant Dis,1991,75(1):51-55.

[5] Leath K T,Kendall W A.Fusarium root rot of forage species:Pathogenicity and host range[J].Phytopathology,1978,68:826-831.

[6] Stuteville D L,Erwin D C.Compendium of alfalfa disease (2nd edition)[M].APS Press,1991：43-44.

[7] 李敏权,柴兆祥,李金花,等.定西地区苜蓿根和根颈腐烂病病原研究[J].草地学报,2003,11(1):83-86.

[8] 严林,梅洁人.青海省紫花苜蓿病虫种类及害虫天敌的调查[J].植物保护,1994,11(4):14-18.

[9] 曹丽霞,赵存虎,白全江,等.内蒙古中部地区苜蓿根腐病病原研究[J].华北农学报,2008,23(5):105-107.

[10] 胡清泉.紫花苜蓿根腐病的发生现状及防治措施[J].内蒙古草业,2009,21(1):37-39.

[11] 潘龙其,张丽,杨成德,等.紫花苜蓿根腐病原菌-拟枝孢镰刀菌的鉴定及其生物学特性研究[J].草业学报,2015,24(10):88-98.

[12] 孔祥辉,刘佳宁,张丕奇,等.东北地区木耳“白毛菌病”的病原菌[J].菌物学报,2011,30(4):551-555.

[13] 张丽,耿肖兵,王春玲,等.黑龙江省大豆镰孢根腐病菌鉴定及致病力分析[J].植物保护,2014,40(3):165-168.

[14] Lazreg F,Lakhdar B,Belabid L,etal.First Report of Fusarium chlamydosporum Causing Damping-Off Disease on Aleppo Pine in Algeria[J].Plant Disease,2013,97(11):1506.

[15] Gupta Vijai Kumar,Misra Ashok Kumar.Fusarium chlamydosporum causing wilt disease of guava (PsidiumguajavaL.) in India[J].Archives of Phytopathology and Plant Protection,2012,45(20):2425-2428.

[16] de Oliveira Rocha L,Reis GM,da Silva V N,etal.Molecular characterization and fumonisin production by Fusarium verticillioides isolated from corn grains of different geographic origins in Brazil[J].Int J Food Microbiol,2011,145(1):9-21.

[17] Yamaki S.Property of sorbitol-6-phosphate dehydrogenase and its connection with sorbitol accumulation in apple[J].HortScience,1980,15:268-270.

[18] Bellaloui N,Brown P H,Dandekar A M.Manipulation of invivo sorbitol production alters boron uptake and transport in tobacco[J].Plant Physiol,1999,119:735-741.

[19] 邢来君,李明春.普通真菌学[M].北京:高等教育出版社,1999:100-101.

[20] 潘虹,关凤芝,吴广文,等.尖饱镰刀菌亚麻专化型生物学特性研究[J].东北农业大学学报,2011,(42)7:50-56.

[21] 杨海涛,李志洲,红汁乳菇色素稳定性的研究[J].氨基酸和生物资源,2004,26(3):27-29.

[22] 张银.丝状真菌发酵生产食品色素的研究[J].中国调味品,2015,40(1):115-118.

[23] 王风琴,许兵,孙云飞.一株南极真菌的鉴定及其分泌色素性质分析[J].中国食品报,2013,13(3):189-195.

[24] 侯幼红,吕江陵,黄瑛,等.真菌色素与真菌感染[J].中国真菌学杂志,2008,3(6):375-380.

Biological characteristics of Fusarium chlamydosporum, a new pathogen cause alfalfa root rot

BAI Yu-jing1，ZHANG Zhen-ming2,YAO Yu-ling1，XUE Li1，ZHANG Zhen-fen3,YANG Cheng-de1

(1.Collegeofplantprotection,GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070,China； 2.Gansugrasslandtechnicalextensionstation,Lanshou730010； 3.CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem，MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

This study used fungus cake method to determinate the biological characteristics ofFusariumchlamydosporumunder different condition in term of temperature,illumination,pH value,C-sources and N-sources,and observed the situation of pigment produced by mycelium in different C-sources and N-sources.The result showed that the pathogen can grow when the range of temperature from 5℃ to 40℃,and the optimum temperature was 25℃.It can grow when the range of pH were 4.0～12.0,and the optimum pH was 7.0.All dark condition promotes the mycelium growth.The optimum C- sources and N-sources were sorbitol and peptone,C-sources chloralose and other eight kinds of N-sources beside peptone all limited the mycelium's growth.Mycelium can produce different pigment in different C-sources and N-sources,and the change of pigment had great difference.At different growth stages,the color of the pigment was also changed.

alfalfa root rot；Fusariumchlamydosporum；biological characteristics；pigment

2016-01-11；

2016-04-11

甘肃省农牧厅项目；国家自然科学基金(314 60639)和甘肃省自然科学基金项目(145RJZA130)资助

柏玉晶(1989-),女,甘肃景泰人,在读硕士研究生。 E-mail：1345491709@qq.com 杨成德为通讯作者。

S 435.4

A

1009-5500(2016)06-0049-06