代谢组学技术在烟草研究中的应用进展

王小莉，付 博，赵铭钦，贺 凡，王鹏泽，刘鹏飞

（河南农业大学烟草学院，国家烟草栽培生理生化研究基地，郑州 450002）



代谢组学技术在烟草研究中的应用进展

王小莉，付 博，赵铭钦*，贺 凡，王鹏泽，刘鹏飞

（河南农业大学烟草学院，国家烟草栽培生理生化研究基地，郑州 450002）

摘 要：简述了作为研究植物生理生化和基因功能新方法的代谢组学在烟草研究中的主要技术流程及其应用现状，归纳了不同生态环境和不同组织中烟草代谢物差异及产生原因，总结了生物和非生物胁迫及化学诱导处理等条件下的烟草生理生化变化及相关基因功能。最后提出了目前烟草代谢组学研究所面临的问题，并指出与其他组学整合应用是代谢组学在烟草研究领域的发展趋势。

关键词：烟草；代谢组学；胁迫；化学诱导；基因功能

代谢组学与基因组学、转录组学和蛋白质组学分别从不同层面研究生物体对环境或基因改变的响应，它们都是系统生物学的重要组成部分。植物代谢组学是21世纪初产生的一门新学科，主要通过研究植物的次生代谢物受环境或基因扰动前后差异来研究植物代谢网络和基因功能［1-2］。与微生物和动物相比，植物的独特性在于它拥有复杂的代谢途径，目前发现的次生代谢产物达20万种以上［3］。代谢物差异是植物对基因或环境改变的最终响应［4］，因此，对代谢物进行全面解析，探索相关代谢网络和基因调控机制，是从分子层面深入认识植物生命活动规律的一个重要环节［5-7］。

烟草不仅是重要的经济作物，同时还是一种重要的模式植物，作为生物反应器在研究植物遗传、发育、防御反应和转基因等领域中具有重要意义［8-10］。烟草代谢物非常丰富，目前从烟叶中已鉴定出3000多种［11］，且代谢物理化性质和含量差异较大，给烟草化学及代谢规律研究带来挑战。传统的烟草化学主要集中于研究某一类化学成分或某几种重要物质，如萜类［12］、生物碱类［13］、多酚类等［14］，这很难全面地系统地阐述烟草代谢网络。随着系统生物学的发展，烟草越来越广泛地被用于基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学的研究中，例如采用系统生物学的方法找出目标物质的功能基因和代谢通路，通过基因修饰和田间管理减少有害物质的合成、增加香味物质的积累、培育低危害高香气品种等等。因此，将代谢组学用于烟草生理生化、基因功能及代谢通路研究中十分必要，而且已经取得了丰硕的成果。本文对代谢组学技术在烟草研究中的应用进行了综述。

1　烟草代谢组学主要技术流程

植物代谢组学是植物学、有机化学、分析化学、化学计量学、生物信息学、统计学等多门学科的交叉整合，具有整体性、高通量和无偏向性等特点［15］。从分析流程上讲可以分为样品制备、数据采集和数据处理等三大部分。样品制备包括植物组织或细胞的培养、采集、代谢物的提取和分离等步骤［16］，每个步骤都直接关系到结果的可靠性。

数据采集目前使用最广泛的技术平台是具有高通量、高分辨率、重现性好和操作简单等特点的核磁共振（NMR）和质谱（MS）及其联用技术，如气相色谱-质谱（GC-MS）、液相色谱-质谱（LCMS）、毛细管电泳-质谱（CE-MS）联用等，满足了代谢组学对尽可能多的化合物进行检测的目标，根据研究对象性质可选择合适的分析平台，如GC-MS主要用于分析易挥发及衍生化的初生代谢物，LC-MS主要用于分析次生代谢物和脂类，CE-MS主要用于分析可离子化的初生代谢物［17］。

另外，所有组学都会产生大量的数据，代谢组学也不例外。代谢组学的数据处理主要包括：原始数据的预处理、统计分析、代谢物及路径识别和代谢网络的构建［18］，庞大而复杂的数据处理和信息挖掘过程需要综合运用多种统计软件和数据库，从而得出正确的生物学信息。这是代谢组学的重点和难点，也是其区别于传统植物化学研究的独特之处。

2　烟草代谢组学研究进展

2.1 不同生态环境下烟草代谢组学研究

烟草中代谢物的合成与积累易受光照、温度、降水、海拔、土壤质地等生态因素影响，造成不同地区烟叶中代谢物产生明显差异，并最终形成了不同生态区烟叶的风格特色和质量差异。通过代谢组学的方法可以深入认识不同生态环境对烟草代谢物合成与积累的影响。

采用GC-MS、CE-MS和LC-MS技术对津巴布韦和国内（云南）烟叶以及国内三个地区（云南、贵州和河南）的烟叶进行脂质组和代谢组学分析，找到了区分各地区烟叶的差异代谢物，并分析了代谢物差异的产生与气候因子的关系［19-24］。结果显示，云南烟叶比津巴布韦烟叶富含糖类，但蔗糖、山梨醇、葡萄糖酸和某些氨基酸较少。国内3个地区的鲜烟叶脂质组和代谢组轮廓都有显著差异，主要表现为高不饱和度的半乳糖脂、磷脂酰乙醇胺、主要的卵磷脂、多酚、氨基酸和多胺含量在云南烟叶中高于贵州和河南烟叶；低不饱和度半乳糖脂、三酰基甘油、具有三羟基长链碱基的葡糖神经酰胺、酰化甾醇糖苷在河南烟叶中最高，其次是贵州和云南烟叶。将代谢物和气候因子进行关联分析，结果显示温度因素至关重要，能够影响半乳糖脂中脂肪酸的不饱和度和多酚的积累。Zhang Li等［25］和Zhao Y等［26］运用GC-MS技术对不同地区鲜烟叶进行代谢轮廓分析，能很好地区分云南、贵州和河南烟叶，并找到20种差异代谢物，探讨了代谢物差异与不同气候因子间的关系。结果显示，3个地区的烟叶中代谢物含量有明显差异，如与三羧酸（TCA）循环相关的有机酸（异柠檬酸、柠檬酸盐和延胡索酸盐等）和抗氧化剂（如奎尼酸、绿原酸和抗坏血酸）含量在贵州烟叶中最高。代谢物含量与气候因子（降雨、日照和温度）之间的相关性分析表明，干旱有利于糖和氨基酸的积累。Ma D M等［27］基于GC-MS和顶空固相微萃取（HS-SPME）联用技术对美国、印度和巴西烟叶中的挥发性物质进行分析，差异性代谢物主要有降茄二酮、螺岩兰草酮、日齐素等。这表明，代谢组学技术适用于烟叶的代谢轮廓分析和不同生态环境下差异代谢物的评估。

2.2 烟草胁迫代谢组学研究

烟草在生长发育过程中不可避免地会受到各种生物和非生物胁迫，如紫外线、旱灾、洪涝、高温、低温、盐碱、病虫害、机械损伤等。这些逆境因素会对烟草的正常生长发育产生不利影响，使烟叶代谢物产生较大差异［28］。植物代谢产物尤其是次生代谢产物是植物在长期生长和进化过程中对周围生态环境慢慢适应的结果，植物在受到环境变化、机械损伤或病原微生物浸染后，会产生并积累次生代谢产物，用以增强自身的抵抗力［29］，烟草受到各种逆境胁迫时其代谢产物也会发生显著变化。运用代谢组学的方法研究烟草受胁迫条件下代谢物变化规律已经成为一种切实可行的技术手段。

Choi Y H等［30］运用NMR对正常烟叶和系统获得性抗性（SAR）烟叶感染烟草花叶病毒（TMV）后进行代谢组学分析，鉴定出烟叶受感染部分产生与抗性相关的5-咖啡奎尼酸、α-亚麻酸类似物、倍半萜和二萜类等防御物质。结果表明，SAR烟叶与正常烟叶相比各代谢物随时间变化差异明显，但SAR烟叶和首次被TMV感染的烟叶含有的与抗性相关代谢物并没有明显的差异，说明萜类和黄酮类化合物等抗性代谢物的生物合成始于SAR烟叶，黄酮类化合物也在SAR烟叶中诱导产生。Cho K等［31］运用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）分析接种Ppn后烟草代谢物的变化，发现氨基酸、酚类、苯丙素类、脂肪酸类等代谢物差异显著。Ibá ñez A J等［32］采用红外激光解吸电离串联飞行时间质谱（IR-LDI-oTOF-MS）研究了感染Ppn的烟草的防御反应，分析了生物碱和酚类、游离脂肪酸和氧化脂类、糖类以及植物激素类物质的变化，找到了关键代谢物及其代谢途径，为快速评价烟草感染病毒的生物指征提供了新方法。

盐胁迫是植物生长过程中面临的严重的非生物胁迫之一［33］，通过进行烟草盐胁迫下代谢物差异研究，为研究烟草抗逆性提供新思路。Zhang J等［34］采用 NMR对盐胁迫下烟草的代谢物变化情况进行研究，发现烟草中与新陈代谢相关的化合物主要有40类，包括有机酸、生物碱、氨基酸、糖类、胆碱、嘧啶和嘌呤代谢物等。清楚地检测到烟草受不同剂量盐胁迫的代谢物变化轨迹，短时间低剂量的盐胁迫导致代谢物朝着糖异生方向偏移，同时伴随消耗嘧啶和嘌呤代谢物；高剂量长时间的盐胁迫使得渗透物质逐渐积累，如脯氨酸和肌醇，并改变氨基丁酸分路，同时促使莽草酸酯调节的次生代谢中芳香族氨基酸合成增加。这些证据为烟草适应盐渗透提供了新的视角。

2.3 烟草化学诱导代谢组学研究

植物在生长、发育、生殖等过程中，常常受到外界的物理、化学和生物等因素的影响，而在这些影响因素中，体内外的相关化学诱导剂对植物生育过程的影响非常广泛。植物仅仅依靠先天免疫性防御病原体攻击，对具体的应激方式没有记忆力，但在对植物进行预激活之后，当再次受到胁迫时它便能够发动强烈的应激反应［35-36］。化学诱导剂对植物生长、发育、生殖的影响大多是通过作用于植物的启动子来调控植物基因表达和蛋白表达，进而影响植物的生育以及对内外环境的反应［37］。

以往的研究认为植物中只有反式绿原酸，然而在一些受过机械损伤的植物组织中以及暴露于紫外光下的烟叶中，已经发现其顺式异构体［38］。Mhlongo M I等［39-40］用不同的植物防御诱导剂——脂多糖、鞭毛蛋白-22、壳聚糖、活化酯和异亚硝基苯乙酮（INAP）处理烟草培养细胞，发现这些结构和功能多样的诱导剂均能引起绿原酸的积累，包括单酰化和二酰化的咖啡酰奎宁酸（绿原酸，新绿原酸，异绿原酸B和异绿原酸C），提出绿原酸在能动性地参与引发植物防御作用中扮演新角色，首次发现顺式新绿原酸的积累，说明烟草植物中存在产生顺式绿原酸异构体的生物途径。

据文献［41-43］报道，麦角固醇可以激活烟草细胞中的防御基因，从而诱导与防御相关的次生代谢物质产生。Tugizimana F等［44-45］通过多种代谢组学分析平台考察麦角固醇对烟草细胞代谢物的影响。结果表明，麦角固醇可以改变细胞的新陈代谢，并鉴定出防御性代谢物包括5种萜类化合物（辣椒素、鲁比民醛、日齐素、螺岩兰草酮和马铃薯松弛素）、脱落酸（ABA）、植物固醇等。Gaquerel E等［46］研究了烟草受伤和使用蛾诱导剂后代谢物的变化，发现173种代谢物具有统计学差异，其中128种受时间影响，85种受处理方式影响。

鸟氨酸在烟草尿素循环和多胺生物合成中起着重要作用［47-48］，与鸟氨酸的左旋异构体（L-Orn）截然相反，鸟氨酸的右旋异构体（D-Orn）可以积极参与烟草细胞代谢，诱导产生自由态、束缚态和结合态的多胺［49］。Gholami M等［50］采用手性LCMS对氨基酸类物质进行代谢轮廓分析，发现DOrn对左旋精氨酸（L-Arg）有选择性积累的优势，外源D-Orn能选择性使L-Arg调高80倍，而LOrn使所有氨基酸略有增加，说明D-Orn能够选择性调控L-Arg和尿素循环。

Madala N E等［51-52］用INAP分别处理高粱和烟草细胞，考察了 INAP诱导后的代谢物分布变化情况。结果表明，INAP能够诱导代谢物发生可逆变化。高粱细胞比烟草细胞在化学诱导下代谢物变化更协调一致，说明生氰植物和非生氰植物在亚硝基化合物次生代谢方面有差异；推测鉴定出8种代谢物，并指出INAP影响莽草酸途径、苯丙烷途径和类黄酮途径，能促使体内抗氧化环境的产生。

2.4 烟草功能基因代谢组学研究

活性氧和乙烯在确定植物对病原体侵袭是抗性或易感性方面发挥重要作用。为进一步研究其机理，Cho K等［53］对野生烟草和乙烯信号受阻的转基因烟草（Ein3-AS）进行代谢组学研究，通过接种Ppn研究乙烯信号分子在对抗病原菌侵入时的防御功能。结果显示，在Ppn作用下烟碱和苯丙烷-多胺缀合物以及它们的中间体，如精氨酸和腐胺的含量在Ein3-AS转基因植株中低于野生烟草，而半乳糖脂和氧化的游离脂肪酸则相反。

黄酮类在多数植物中通过苯基丙酸类合成途径进行生物合成［54］，Misra P等［55］将拟南芥转录因子 AtMYB12在烟草中表达，促使包括苯基丙酸类合成途径的基因表达增强，从而使得黄酮类物质增加几倍。由于增加了芸香苷的积累，使得转基因烟草对斜纹夜蛾和棉铃虫具有更好的抗性。

Choi H K等［56］和 Halim V A等［57］分别采用NMR和高效液相色谱-光电二极管阵列-质谱（HPLC-PDA-MS）对野生和转基因烟草（过表达合成水杨酸的基因，含高浓度水杨酸及其糖苷，增加烟草对花叶病毒的抗性）进行代谢组学分析，结果表明，绿原酸和芸香苷在转基因烟草中含量比野生烟草中低。这可能是异分支酸和预苯酸途径竞争所致，而水杨酸（SA）作为信号分子调控绿原酸和芸香苷的生物合成。

Mungur R等［58］采用傅里叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR-MS）研究谷氨酸脱氢酶（GDH）转基因烟草。GDH转基因烟草改变了谷氨酸盐、氨基酸和碳代谢，这从根本上改变了烟草的生长发育。通过13NH4+对氨基酸碎片进行生物标记来分析GDH表达、谷氨酸盐和植物表型之间的因果关系和相互影响，发现转基因烟草的13N标记的氨基酸盐和氨基酰胺显著上升，随着GDH活性的变化，根部和叶中上百个离子丰度发生改变，其中具有生物医药意义的有23种。某些氨基酸、有机酸和糖增加，而有些脂肪酸下降，说明转基因使铵吸收增加。

2.5 烟草不同组织器官代谢组学研究

绿原酸是由肉桂酸和奎宁酸分子衍生物形成的酚类物质，它的积累与植物防御多种胁迫下的生理响应联系在一起。Ncube E N等［59］研究了烟叶组织和烟草悬浮细胞中绿原酸及其衍生物的代谢差异，共鉴定出19种含有肉桂酸核的代谢物。这些代谢物在烟叶组织和悬浮细胞中的分布明显不同，说明绿原酸在两种不同的体系中生物合成途径有差异，这需要结合转录组学和蛋白组学对其进行更深入的研究。

2.6 与其他组学结合应用研究

木质素是次生细胞壁的重要成分，肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）和肉桂醇脱氢酶（CAD）是催化木质素单体生物合成的最后两个步骤的关键酶，现已经证实下调烟草中的CCR会降低木质素含量，而在下调CAD的烟草中木质素结合更多的醛［60-62］。Dauwe R等［63］发现，改变烟草中CCR和CAD两个基因中任意一个的表达，都会对其转录组和代谢组产生深远的影响。以基因扩增片段长度多态性为基础的转录谱，结合HPLC和GC-MS代谢物图谱，揭示了木质素单体生物合成的特异转录因子和代谢产物，以及木质素单体和其他代谢途径之间的相互作用的主要网络。

Lippmann R等［64］采用蛋白质组学和代谢组学相结合的方法研究了烟草悬浮细胞分泌蛋白质的过程。结果显示在胁迫处理或缺乏诱导子时胁迫相关的蛋白质和代谢物丰度加强，在胁迫防御和细胞再生过程中鉴定出32种蛋白质，腐胺明显上升。Ferrario-Mery S等［65］研究了烟草中碳氮相关的代谢途径，整合了该代谢路径中转录组、酶活性及代谢组学的相互关系。通过对NH4+代谢过程中主要代谢物的定量分析，并整合先前关于氮在转录方面的知识，分析了谷氨酰胺合成酶在氮代谢过程中的作用，结论是代谢物量的变化与转录水平无关，而与转录后修饰调节有关。

3　展望

随着各种分析技术在分辨率、检测限和准确度等方面的不断提高，信息生物学的不断完善以及各组学之间的结合，代谢组学也越来越广泛地应用于系统生物学的研究之中。从最初的代谢产物分析、单一代谢途径探索走向与其他组学技术结合，研究特定的生物学问题，共同揭示植物生理活动的奥秘。代谢组学技术在烟草研究方面已经取得了较为丰硕的成果，成为全面地系统地研究烟草在应对外界环境和胁迫条件下的代谢物响应变化的重要手段。但从总体来看，目前烟草代谢组学仍然处于初级阶段，在分析技术、数据处理和生物信息整合等方面均面临着巨大挑战。

首先是分析技术的局限性。代谢组学的深入研究得益于分析技术的不断进步，如高分辨质谱（HRMS）、UPLC、NMR、傅里叶红外（FTIR）、CE及其联用技术的应用。与其他各组学（基因组学、蛋白质组学等）技术只分析特定类型的物质不同，植物代谢物具有复杂多样、理化性质差异大、各组织中分布不均等特点，且在时间和空间上都具有高度的动态性［66］，目前还没有一种能够无偏向性地分析所有代谢物的技术平台。

其次是大量数据的分析处理。代谢组学的高通量性、整体性、系统性、动态性的特点决定了研究过程中将产生大量的数据，如何筛选获取有效数据并对其进行科学解析是一项艰巨的工作，特别是大量代谢物的鉴定。在整合多种统计软件和数据库，提高数据处理的效率和准确性方面同样面临着巨大挑战。

最后是代谢组学与其他组学的结合。代谢组学与基因组学、转录组学及蛋白质组学是研究系统生物学信息传递的几个层次。代谢组学只揭示发生了什么，而研究生物体发生这些改变的原因和过程，需要将几个组学结合起来，因此，代谢组学是服务于基因组学的。如何将代谢组学与其他相关组学以及代谢通路整合在一起，并科学地揭示植物的生理功能是能否发挥代谢组学潜能的重点和难点［67］。

我国《烟草行业中长期科技发展规划纲要（2006—2020年）》中提出，要找到参与烟草抗性、营养吸收、香气形成、烟碱代谢、有害成分合成与降解、烟叶成熟和烘烤等过程中相关的功能基因和蛋白质，培育出高香气低危害品种，为中式卷烟的发展提供特色优质烟叶原料。这些工作的推进都离不开对烟草代谢机理的深入认识，只有全面系统地开展烟草代谢组学基本规律研究，并与其他组学整合、验证，才能更好地指导烟草生产，这是烟草代谢组学未来的发展方向［68-69］。

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Research of Metabolomics in Tobacco

WANG Xiaoli，FU Bo，ZHAO Mingqin*，HE Fan，WANG Pengze，LIU Pengfei
（College of Tobacco Science，Henan Agricultural University，National Tobacco Physiology and Biochemistry Research Center，Zhengzhou 450002，China）

Abstract:Metabolomics has been considered one of the most effective means of investigating physiological and biochemical processes and gene function of plants. Here we review the main process of metabolomics and its application status in tobacco research，the regulation mechanisms of physiological and biochemical reactions when tobacco responds to different environmental，biotic and abiotic stresses，chemically induced processes and genetic modifications. Finally，issues of critical significance to current tobacco metabolomics research are discussed and it is noted that integration with other omics is the trend of metabolomics research in tobacco.

Keywords:tobacco；metabolomics；stress；chemical induction；gene function

中图分类号：S572.01

文章编号：1007-5119（2016）01-0089-08

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.01.016

基金项目：中国烟草总公司浓香型特色优质烟叶开发（110201101001 TS-01）；上海烟草集团责任有限公司“浓香型特色优质烟叶风格定位研究及样品检测”（szbcw201201150）

作者简介：王小莉（1983-），女，博士研究生，主要从事烟草生理生化研究。E-mail：xiaoliwang325@126.com*通信作者，E-mail：zhaomingqin@126.com

收稿日期：2015-09-09 修回日期：2015-11-19