壳寡糖席夫碱纳米银溶液对烟草花叶病防治及烟叶色素的影响

孙翠红，徐翠莲，尤方芳，施守杰，王一丁，赵铭钦*，孙 双，刘 芳，杜林洳

（1.河南农业大学烟草学院，国家烟草栽培生理生化研究基地，郑州 450002；2.河南农业大学理学院，郑州 450002；3.赣州市宁都县烟草专卖局，江西 赣州 342800）



壳寡糖席夫碱纳米银溶液对烟草花叶病防治及烟叶色素的影响

孙翠红1，徐翠莲2，尤方芳1，施守杰1，王一丁1，赵铭钦1*，孙 双1，刘 芳1，杜林洳3

（1.河南农业大学烟草学院，国家烟草栽培生理生化研究基地，郑州 450002；2.河南农业大学理学院，郑州 450002；3.赣州市宁都县烟草专卖局，江西 赣州 342800）

摘 要：为开发防治烟草花叶病的新型药剂，采用大田试验研究了壳寡糖纳米银溶液、壳寡糖席夫碱纳米银溶液及宁南霉素对烟草花叶病的田间防治效果。结果表明，壳寡糖和壳寡糖席夫碱的纳米银溶液对烟草花叶病的防治效果均优于宁南霉素，以预防和治疗效果分别达到53.32%、24.95%的壳寡糖席夫碱纳米银溶液为最好，能够减轻病株叶绿素和类胡萝卜素含量的下降幅度，增强烟株的光合作用强度，使烟株的抗病性得到提高。壳寡糖及其衍生物的纳米银溶液对烟草花叶病具有较好的防治效果，为今后开发绿色、高效的抗TMV药剂提供了新思路。

关键词：壳寡糖纳米银；壳寡糖席夫碱纳米银；烟草花叶病；防治效果；叶绿素

壳寡糖（Chitooligosaccharides，COS）是壳聚糖的降解产物，它是将壳聚糖经生物技术降解而成的相对分子质量较低、聚合度为3～10的低聚β-（1，4）-2-脱氧-2-氨基葡萄糖［1］。由于壳寡糖分子中存在着氨基、一级羟基和二级羟基等活性官能团，因此这些官能团的化学修饰大大的拓宽了壳寡糖在不同领域的应用［2-4］。壳寡糖是植物识别病原真菌入侵的非特异性信号，可以对许多植物显示出强烈的免疫诱导活性，从而可以激发植物的抗病基因的表达［5］，产生能抑制或杀灭病菌的与植物抗病性相关的物质如甲壳素酶、壳聚糖酶、植保素和免疫蛋白质［6-8］，已有研究表明［9-10］，壳寡糖可诱导植物产生抗病性。

席夫碱是一类具有广泛生物活性的化合物，其在抑制烟草花叶病毒活性中的研究已有不少报道［11-12］，我们也报道了壳寡糖席夫碱对烟草花叶病毒具有较好的抑制作用［13-14］。纳米银是一种新型、绿色、抗菌材料，它具有抗病毒活性［15-16］，壳寡糖衍生物纳米银的抗人体病毒活性和抗烟草花叶病毒活性也已有报道［17-19］。烟草花叶病不仅对烟叶产量造成很大的损失，还造成了烟叶品质的下降，使烟叶等级降低，无法满足卷烟行业对优质卷烟原料的要求，因此急需研究开发出一种绿色有效的抗烟草花叶病的药剂。笔者分别以壳寡糖和具有席夫碱结构的新型壳寡糖衍生物合成了其纳米银，并对田间感染烟草花叶病的烟株防治效果进行了试验，以期为新型、绿色、高效的抗烟草花叶病药剂的开发提供依据。

1　材料与方法

1.1 试验材料

2%的宁南霉素水剂（2% ningnanmycin AS）是德强生物股份有限公司产品；壳寡糖（COS，分子量平均约为5000）来自上海国药集团化学试剂有限公司；硝酸银（AgNO3），分析纯，购自天津市科密欧化学试剂开发中心。采用北京普析通用仪器有限责任公司的TU-1901型双光束紫外可见分光光度计进行紫外分析。

1.2 壳寡糖纳米银溶液（COS-Ag）和壳寡糖席夫碱纳米银溶液（S-COS-Ag）的制备

壳寡糖席夫碱（S-COS）的制备参照文献［20］，分别将50 mL 1 mg/mL壳寡糖溶液和壳寡糖席夫碱溶液加入100 mL烧杯中，再分别向其中加入5 mL 10 mg/mL的硝酸银溶液，在80 ℃条件下分别搅拌70、30 min，得到壳寡糖纳米银溶液（COSAg）和壳寡糖席夫碱纳米银溶液（S-COS-Ag）。

1.3 试验地点

试验田设在河南省漯河市临颍县繁城镇马井村，供试品种为中烟100（感普通花叶病）。该田地连续3年以上种植烟草，烟草花叶病常年较明显。试验地地势平坦、灌溉方便、肥力中等、通风向阳，土壤质地为砂质-粘质潮土（其中氯离子28.400 mg/kg，速效钾99.814 mg/kg，速效磷24.769 mg/kg，pH 6.34，有机质17.095 g/kg，碱解氮77 mg/kg）。4月底移栽，株行距为120 cm×55 cm，每个处理（小区）面积533.36 m2，随机区组试验设计，重复3次，四周设保护行。其他管理措施与大田管理一致。

1.4 病情分级标准

烟草花叶病分级标准参照文献［21］。

1.5 试验设计

试验设4个处理，分别为T1：稀释260倍的宁南霉素水剂；T2：质量浓度为10 µg/mL的COSAg溶液；T3：质量浓度为10 µg/mL的S-COS-Ag溶液；CK：清水（对照）。在大田环境下进行，烟株生长健壮，长势均匀，自然发病。试验分为预防试验和治疗试验。

预防试验：在烟株移栽后15 d选择没有发病的烟田喷洒药剂，连续喷药4次，每次间隔10 d。

治疗试验：于2014年5月25号、6月4号、6月14号、6月24号进行喷药。5月25号对试验田进行普查，发现有零星烟草花叶病烟株，6月18号达到发病高峰。

在3次喷药后每7天时间观察记载发病情况，根据烟草花叶病的分级标准进行记录。在5月25号时，挂牌随机选取几株感染烟草花叶病的烟株，以中部烟叶为研究对象，分别在5月25号、6月4号、6月14号和6月24号取样（4个取样日期分别记作1、2、3、和4次），采用乙醇提取法［22］研究不同处理下烟叶色素含量变化。

1.6 数据分析处理

采用SPSS 19.0对数据进行差异性分析，采用Excel 2007对数据进行统计分析并作图。

2　结果

2.1 COS-Ag和S-COS-Ag的紫外分析

COS、S-COS、COS-Ag和S-COS-Ag的紫外图谱扫描曲线如图1所示，COS在270 nm处有一个强而窄的吸收峰，与COS相比，S-COS在319 nm处存在着吸收强度较弱的酚亚胺基团的吸收峰，COS-Ag在410 nm左右处出现了纳米银粒子的特征等离子共振吸收峰；与 S-COS相比，SCOS-Ag也在410 nm左右处出现了纳米银粒子的特征等离子共振吸收峰；因此，由上面分析可知有纳米银粒子的形成。

2.2 药剂对烟草花叶病毒的预防效果

各处理药剂对感染烟草花叶病毒烟株的预防效果如表1所示，与对照相比，各个处理对感病烟株均有较好的抑制作用，且各个时期下的病情指数与对照之间的病情指数存在着极显著和显著性差异；由预防效果可以看出，以防治效果53.32% 的T3处理（S-COS-Ag处理）为最佳，COS-Ag处理和S-COS-Ag处理对感染烟草花叶病毒的烟株的防治效果均优于宁南霉素处理。

2.3 药剂对烟草花叶病毒的治疗效果

图1　壳寡糖及其衍生物的紫外光谱图Fig.1 The UV-Vis of COS and its derivatives

由表2所示，各个处理（对照除外）对感病烟株均有较好的抑制作用，与对照相比，各个处理下各个时期烟株的病情指数均得到了有效的控制，T1处理与对照之间存在着显著性差异，T2和T3处理与对照之间的病情指数存在着显著性和极显著性差异；从防治效果可以看出，不同调查时期下COS-Ag处理和S-COS-Ag处理对感染烟草花叶病毒的烟株的防治效果均优于宁南霉素处理，其防效比宁南霉素处理分别高出了 59.51%、79.76%。故壳寡糖以及其衍生物纳米银对感染烟草花叶病的烟株有很好的抑制作用，尤壳寡糖衍生物纳米银的效果较佳。

表1　药剂对烟草花叶病毒的预防效果Table 1 The prevention effect of reagents on TMV

表2　药剂对烟草花叶病毒的治疗效果Table 2 The treatment effect of reagents on TMV

2.4 药剂对烟株色素的影响

2.4.1 各处理下烟叶叶绿素a和叶绿素b的含量变化 不同处理下烟叶叶绿素a含量的变化如图2所示，各个处理下烟叶叶绿素a含量随着取样时间的推进逐渐降低，与农业上防治烟草花叶病常用的宁南霉素相比，COS-Ag处理和S-COS-Ag处理下叶绿素降幅较小，尤以S-COS-Ag处理下效果最好。T3处理与对照之间差异性较明显。因此，S-COS-Ag处理可有效的缓解感染烟草花叶病烟叶叶绿素a的下降幅度。

各个处理下烟叶叶绿素b含量随时间的变化如图3所示，各个处理下叶绿素b含量随时间变化同叶绿素 a，与对照和宁南霉素处理相比，SCOS-Ag处理下的叶绿素b降幅最小；S-COS-Ag处理与对照相比存在着显著性差异。因此，S-COSAg处理可有效的减小感染烟草花叶病烟叶叶绿素b的下降幅度。

图2　不同处理下烟叶中叶绿素a的含量变化Fig. 2 The changes of the contents of chlorophyll a under different treatments

图3　不同处理下叶绿素b的含量变化Fig. 3 The changes of the contents of chlorophyll b under different treatments

2.4.2 各处理下烟叶类胡萝卜素含量的变化 不同处理下烟叶类胡萝卜素含量随着时间的变化呈现逐渐降低的趋势（图4），COS-Ag处理和S-COSAg处理均可有效的缓解类胡萝卜素含量的下降，尤以S-COS-Ag处理效果最好；T3处理与对照之间差异性较明显。因此，S-COS-Ag处理在一定程度上对感染烟草花叶病的烟株进行光合作用具有一定的保护作用。

图4　不同处理下类胡萝卜素的含量变化Fig. 4 The changes of the contents of carotenoid under different treatments

3　讨论

与农业上广泛使用的宁南霉素相比，壳寡糖纳米银和壳寡糖席夫碱纳米银对大田感染烟草花叶病的烟株具有较好的预防和治疗效果，最大防治效果可分别达到53.32%、24.95%，这比已报道的［23-24］显著提高，因此可对烟株采取以预防为主、治疗为辅的措施，药剂的防治效果可能与壳寡糖自身或者席夫碱的抗病性有关，也有可能与纳米银的抗病性有关［17-18，25-28］。

植物叶片的叶绿素含量与植物的抗病性有着密切的关系，叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，叶绿素含量高，光合作用相对较强，植物的抗病性增强［29］。研究表明，受到病毒侵染的植物叶绿体受到破坏，叶绿素含量降低，植物的光合电子传递活力下降，光合磷酸化作用降低［30］，进而植物的抗病性减弱。本研究表明，感病的烟株叶绿素含量随着时间的变化表现为下降的趋势，药剂处理可有效的缓解叶绿素a和叶绿素b的下降幅度，这可能是因为药剂处理可使分解叶绿素的酶活性降低，从而缓解叶绿素含量的下降。类胡萝卜素是植物进行光合作用不可缺少的光合色素，植物在受到迫害的胁迫下，类胡萝卜素含量也受到相应的影响，进而影响植物的光合作用，研究得出，壳寡糖以及其衍生物纳米银可有效的缓解类胡萝卜素含量的下降幅度。因此，壳寡糖席夫碱纳米银有望成为一种新型农药。

4　结论

壳寡糖及其衍生物的纳米银溶液在大田诱导烟株抗烟草花叶病方面具有较好的防治效果，这为今后开发新的抗TMV药剂提供了新思路。关于壳寡糖及其衍生物纳米银对 TMV的农药残留尤其是银离子残留量对烟叶氯离子的影响和烟叶品质的影响缺乏深入的研究，因此，围绕上述问题开展相关研究成为下一步的研究目标。

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The Control Efficiency of COS-Ag to TMV in Tobacco and Its Effect on Tobacco Pigment

SUN Cuihong1，XU Cuilian2，YOU Fangfang1，SHI Shoujie1，WANG Yiding1，ZHAO Mingqin1*，SUN Shuang1，LIU Fang1，DU Linru3
（1. National Tobacco Cultivation & Physiology & Biochemistry Research Center，College of Tobacco，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；2. College of Science Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；3. Ningdu Tobacco Monopoly Bureau，Ganzhou，Jiangxi 342800，China）

Abstract:In order to develop a new kind of green and high efficiency agent against tobacco mosaic virus （TMV），chitooligosaccharides silver nanoparticles （COS-Ag） solution and chitooligosaccharides schiff base silver nanoparticles （S-COS-Ag）solution were synthesized and tested for their control efficiency on TMV in the field. The results showed that not only COS-Ag solution had good control efficiency on TMV，but also the solution of S-COS-Ag. The S-COS-Ag solution was better than COS-Ag solution. The prevention and treatment effect of S-COS-Ag solution on TMV was up to 53.32% and 24.95% in the field，respectively. The SCOS-Ag solution could inhibit the decrease of chlorophyll content and carotenoid content，with the intensity of photosynthesis enhanced at the same time. As a result，the resistance of tobacco was improved. Therefore，chitooligosaccharides silver nanoparticles （COS-Ag） solution can improve the resistance of tobacco to TMV.

Keywords:chitooligosaccharides silver nanoparticles（COS-Ag）；chitooligosaccharides schiff base silver nanoparticles（S-COS-Ag）；tobacco mosaic virus（TMV）；control efficiency；chlorophyll

中图分类号：S435.72

文章编号：1007-5119（2016）01-0061-06

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.01.011

基金项目：河南省烟草公司重点科技攻关项目“预防烟草病毒病的新型生物制剂应用技术与示范”［HYKJ201015］，“预防烟草花叶病毒病的生物制剂纳米增效研究”［HYKJ201307］

作者简介：孙翠红（1988-），女，硕士，主要从事烟草化学研究。E-mail：13838144121@163.com。*通信作者，E-mail：zhaomingqin@126.com

收稿日期：2015-05-20 修回日期：2016-01-21