悬浮培养技术在兽用疫苗领域的应用

严　石，黄文强，刘兆环，杨君敬，杨小蓉，陈秋阁，周蕾蕾（.中牧实业股份有限公司，北京丰台00070；.乾元浩生物股份有限公司，北京丰台00070）



悬浮培养技术在兽用疫苗领域的应用

严石1，黄文强1，刘兆环1，杨君敬1，杨小蓉1，陈秋阁2，周蕾蕾2
（1.中牧实业股份有限公司，北京丰台100070；2.乾元浩生物股份有限公司，北京丰台100070）

1　动物细胞培养技术的发展历史

细胞培养是现代生物科学中发展较为迅速的一门实验技术，动物细胞培养技术也因此备受关注，其历史可追溯到1907年，美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基成功地在试管中培养了蛙胚神经组织，创立了体外组织培养法［1］。1951年Earle等成功开发出能促进动物细胞体外培养的培养基。1957年Graff用灌注培养法悬浮培养细胞，数量达到1×1010～2×1010个/L。1962年，Capstick等对BHK21细胞驯化实现悬浮培养［2］，并用于兽用疫苗生产［3］。1967年，Van Wezel开发了微载体［4］并实现在生物反应器中大规模培养贴壁细胞。随着细胞生物学、培养方法及培养工艺等领域的不断丰富和完善，动物细胞培养技术已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为生物技术产业的重要部分。

2　悬浮培养技术的优势及核心要素

动物细胞的体外培养有两种类型：一类是贴壁依赖性细胞，另一类是非贴壁依赖性细胞。细胞悬浮培养技术是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，细胞悬浮于培养基中生长或维持，规模可以由几升甚至扩大到几千升，容器之间为管道化的连接，细胞在处于运动状态的培养基中生长，辅助以通入CO2和空气，以保证足够的气体交换及pH值的调节，通过震荡或转动装置使细胞始终分散悬浮于培养液内进行培养。与传统工艺相比其优势在于增加了单位体积细胞的数量，减少了污染细胞的机率，自动化程度高，减少人为操作的因素，生物反应器容积的放大，提升了生物制品的均一性，大大降低由接种疫苗导致的副反应，免疫效果更为理想。对应的技术包括悬浮细胞系筛选及驯化、最适细胞培养基的选择、生物反应器的选择、细胞培养工艺的选择等核心要素。

2.1悬浮细胞系的筛选及驯化一种细胞在不同状态下培养时对病毒的敏感性会有所差异，即便是同种细胞的不同克隆株之间对同一种病毒也会表现出不同的敏感性，因此在使用某种细胞系进行大规模疫苗生产前首先要与准备增殖的病毒进行相互适应性选择，再根据细胞的生长特性选择易于生长、放大的反应器及培养工艺，原因是细胞在悬浮培养前需要经过驯化，驯化好的细胞再根据其不同生长状态去选择适宜的反应器与工艺。

细胞驯化的通用方法是逐步改变环境条件，待细胞适应后再继续改变条件，直至细胞能在特定的条件中稳定生长为止。由于特定细胞的营养需求不同，实现其驯化的难易程度也不同，在驯化时应尽量采用营养全面的培养基，并有针对性地补充某些营养成分（如促生长因子、维生素、激素、氨基酸、微量元素等）以满足细胞的特定需求，并且驯化好的细胞可以保持其悬浮和无血清生长的特性。

适合悬浮培养的细胞需要具有：生物稳定性高、生长速率快、活力高、产品生产周期短、产品表达效率高、可满足工业化大规模生产需求等特点。目前有报道称BHK细胞、CHO细胞、Vero细胞成功驯化，可在无血清培养基中悬浮培养［5］。

2.2最适细胞培养基的选择在细胞悬浮培养过程中，培养基的选择也是重要环节。通常情况下，血清是动物细胞生长所不可或缺的营养成分，但由于血清成分较为复杂，不同批次间的成分各异，给疫苗的生产带来诸多不便［6］。目前，在动物细胞悬浮培养中无血清培养基已逐步替代了常规培养基［7］，随着生产工艺的优化，无动物成分来源培养基的使用可以有效降低培养、纯化成本、提高疫苗产品稳定性［8］。另外，由于一种无血清培养基并不能适用于多种细胞的培养，不同细胞甚至相同细胞的不同细胞株都无法使用同一种培养基，因此只有根据自身的工艺需求使用适合自身的个性化培养基，这也是各研发机构企业所面临的主要问题。研究发现，在无血清的培养基中添加某些特定生物活性因子，如纤连蛋白、转铁蛋白和胰岛素等，细胞可有效生长繁殖［9］，如胰岛素是无血清培养基中的重要活性因子，它具有促进动物细胞生长繁殖的能力。有试验表明，CHO细胞能在仅含重组人胰岛素的一种蛋白成分的无血清培养基中连续传代［10］。

2.3生物反应器的选择生物反应器是一种以活细胞或酶为生物催化剂并为细胞的生长和繁殖提供无菌环境的设备，是细胞悬浮培养过程中的关键设备。近几十年来，随着生物工程和组织工程学的发展，相应的生物反应器水平也在不断提高。现已研制出多种不同用途、型号的动物细胞生物反应器，其性能也日趋完善［11-13］。生物反应器的种类主要包括：有搅拌式、气升式、膜式、流化床式、旋转式、固定床式、波式、灌注式等。因此，生物制品生产企业在选择反应器的时候，首先需考虑生产的系统性、适用性，即针对细胞类型及生产工艺选择适合的生物反应器，所选反应器应具有良好的混合功能，便于营养的供给及废物的排出，充分的氧气供给，低剪切力；对于固定化培养或是贴壁细胞来说还应注意表面积与体积比、功能及产品的稳定性等需求特点。

在国外生物制品生产中采用的多是较大规模的、能逐级放大的生物反应器，如搅拌式生物反应器，因其操作简单，既适应悬浮细胞培养，也适合贴壁细胞微载体培养，并且规模易于放大，广泛用于多种细胞系及多种生物制品的生产。国内也多采用搅拌式生物反应器，但只有少数厂家使用，而且规模较小，且多依赖进口。

2.4细胞培养工艺的选择细胞培养工艺在大规模培养中的作用至关重要，按照培养方式主要分为批培养、流加培养、半连续式培养、连续式培养及灌注培养。各种培养工艺都有相对应的生物反应器类型，并均具有各自的特点，针对不同的细胞株及其产品特性，选择适合的培养工艺是当前的一个研究热点，进行动物细胞大规模培养，首先选定合适的生产工艺，其次是考虑与之相匹配的工艺设计，再次是工艺的稳定性。如Vero细胞可用多种方式培养，但是与批培养和流加培养相比，灌注培养可通过动态地调节培养基的灌注速率，保证Vero细胞获得充足的营养供给，不断去除有害代谢废物的积聚，从而提高细胞生长密度和病毒扩增效率。

3　细胞悬浮培养技术在兽用疫苗中的应用

随着中国养殖业的不断发展，动物疫病的暴发与流行在某些地区呈上升趋势，目前控制动物疫病最行之有效的方法就是使用疫苗进行预防，而有效提高疫苗病毒的滴度、进行工业化大规模生产是生产疫苗的关键环节，动物细胞悬浮培养技术在推进兽用疫苗大规模生产中起决定性作用。

3.1细胞悬浮培养技术在口蹄疫疫苗生产中的应用口蹄疫作为国际兽医局规定的A类传染病，在世界许多国家和地区广泛流行。接种安全、高效的疫苗是预防口蹄疫疫情发生的最有效策略之一。当前使用反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒是显著提高口蹄疫病毒抗原浓度有效途径，主要集中在印度、巴西、阿根廷等国家。据悉印度的口蹄疫生产企业使用8000 L生物反应器生产口蹄疫疫苗，巴西的口蹄疫生产企业采用5000 L生物反应器生产口蹄疫疫苗。

20世纪的60年代的国外口蹄疫疫苗生产企业使用的细胞培养液是添加牛血清、磷酸肉汤或水解乳蛋白，由于添加成分如血清的差异而引起细胞培养状态的差异，从而影响疫苗质量。同时在口蹄疫强制免疫的国家，牛血清中含有口蹄疫病毒抗体的可能性较大，由此影响细胞的产毒效果。从20世纪80年代起，国外细胞培养基发展迅速，低血清、无血清细胞培养基已逐步商品化，受国外细胞培养技术的影响，国内研究机构逐步进行产品培养工艺的升级，开发出了低血清、无血清细胞培养基及悬浮培养技术，并应用到口蹄疫疫苗生产中，并结合细胞悬浮培养技术生产的口蹄疫抗原146S浓度达到3 μg/mL，生产成本下降30%［14-18］。

3.2细胞悬浮培养技术在禽流感病毒疫苗生产中的应用目前国内的动物用流感病毒疫苗的生产大多采用鸡胚，这种传统的方法存在着生产周期长，劳动强大，鸡胚用量大的问题，除此还受生物安全、残余鸡胚蛋白等问题影响，由此迫切需要一种新的疫苗生产方法，采用细胞悬浮培养生产的流感疫苗与传统方法相比具有周期短，病毒滴度不低于鸡胚滴度［19］，自动化程度高，疫苗质量更易控制等优点。

国外悬浮培养技术生产流感病毒使用的哺乳动物细胞主要有Vero细胞、MDCK细胞、PER.C6细胞。有报道称，Novartis公司于2007年用MDCK细胞生产了流感疫苗Optaflu并上市。Baxter公司于2009年通过Vero细胞技术平台生产了禽流感疫苗CELVAPAN并上市，此平台可逐级放大至6000 L，细胞密度达到2×106～3×106/mL。

国内禽流感疫苗的生产工艺发展较为落后，现已有多家单位正在开发细胞生产禽流感疫苗工艺。杨涛等研究结果表明，利用MDCK细胞扩增重组H5N3疫苗株时可获得有效的增殖［20］。李春艳等同样使用MDCK细胞悬浮系统对H9N2的生长繁殖情况进行了研究，结果表明，在微载体浓度为5 g/L时可以为H9N2病毒的大规模生产提供较好的产率和成本的平衡［21］。山东信得利用细胞悬浮培养技术，实现了应用生物反应器进行细胞大规模悬浮培养生产禽流感疫苗的重大工艺，获得了重组禽流感病毒（H5N1亚型）灭活疫苗的生产文号。

3.3细胞悬浮培养技术在其他畜禽疫苗生产中的应用当前我国畜牧业的发展不仅面临着重大疫病的挑战，同时还受其他疫病的威胁。如猪繁殖与呼吸综合征、猪流行性腹泻、猪瘟、流行性乙型脑炎、狂犬病、鸡传染性囊病等。控制这些疾病的有效措施就是使用疫苗，随着细胞悬浮培养技术的不断发展，多种疫苗已经实现了规模化生产。冯磊等在Marc-145细胞上使用微载体悬浮培养的方式大规模培养猪繁殖与呼吸综合征病毒并取得较高的病毒效价，在3 g/L的微载体用量下，采用3×105个/mL的初始细胞接种，培养至第3天可获得最佳的细胞生长效能，采用感染复数为0.05的接毒比例及接毒后48 h收获毒液可获得最高的猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖效价［22］。周燕等使用Vero细胞悬浮培养系统对猪流行性腹泻病毒进行大规模生产的摸索，结果表明，接种密度为1.5×105个/mL时，可获得较高的细胞密度，随着微载体浓度的提高，最高细胞密度也增加，在CelliGen反应器中，采用优化的培养条件，细胞密度可达到1.74×106个/mL，达到方瓶培养的3.5倍，每个细胞的猪流行性腹泻病毒含量与方瓶培养相当，制备的疫苗免疫原性好［23］。洛阳普莱柯生物工程有限公司利用传代细胞悬浮培养方式成功地对猪瘟病毒进行了大规模生产。该生产方式可以较大程度地提高单位容积的细胞生产量，提高单位抗原效价10～100倍，能有效的减少外源病毒污染及提高产品质量。李薇等在悬浮培养的Vero细胞上进行大规模繁殖流行性乙型脑炎病毒且摸索出较为理想的消化条件及消化液，并建立了适合大规模生产的消化放大程序，为细胞放大至下一级细胞罐中奠定了基础，也为培养规模的进一步放大建立了方法［24］。Perrin等利用BHK-21悬浮培养系统对狂犬病疫苗进行了试验性研究，结果表明，应用槽注系统的生物反应器可获得高滴度的狂犬病病毒，制造试验疫苗并用小鼠测试证明有良好的保护活性［25］。石岗等利用生物反应器培养Vero细胞进行鸡传染性囊病病毒的研究，确定鸡传染性囊病病毒在Vero细胞上增殖的最佳培养条件，比传统转瓶生产方法至少提高1个毒价，可用于其规模化生产［26］。

4　小结

在国外，随着悬浮培养技术在人用疫苗生产领域中的广泛应用，并逐渐应用到兽用疫苗领域，技术发展相对成熟，在国内，细胞悬浮技术虽然起步较晚，但经过不断的探索与研究，动物细胞大规模培养技术已有了飞速发展［27］。在其发展的过程中，掌握悬浮细胞系选择、最适细胞培养基的选择、生物反应器的选择、细胞培养工艺的选择4个核心要素，才能使细胞悬浮培养的应用变得越来越容易，从而推动兽用疫苗规模化生产的发展。疫苗产品的竞争实质是其关键核心技术的竞争，质量的竞争，谁在未来掌握了反应器悬浮培养技术生产平台及工艺，谁就有机会在下一轮行业发展中掌握市场主动权。

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中图分类号：Q813，S859.79

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）03- 0076- 03

收稿日期：2015-05-21

作者简介：严石（1979-），男，兽医师，硕士，从事兽医生物制品研发工作，E-mail：348208535@qq.com