基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在临床微生物检验的应用进展

李　欣　高海军　张　勤　许建成

(吉林大学第一医院检验科，吉林　长春　130021)



基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在临床微生物检验的应用进展

李欣高海军1张勤许建成

(吉林大学第一医院检验科，吉林长春130021)

〔关键词〕基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；微生物；鉴定

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)是一种新型的质谱技术，具有灵敏度高，样品用量少，分析速度快的特点。目前，MALDI-TOF已开始应用于多项微生物的检测，为临床疾病的诊疗提供有效的指导。

1MALDI-TOF鉴定微生物的特点及优势

MALDI-TOF系统由基质辅助激光解吸电离离子源(MALDI)、飞行时间质量分析器(TOF)和检测器组成，属于一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定〔1〕。其原理是利用激光照射待测物与基质形成的共结晶薄膜，通过基质吸收能量并将能量转移至待测物分子，使分子解离成离子，利用离子在电场中运动的性质，按离子质菏比(m/z)的大小顺序进行收集和记录，得到质谱图,与数据库中各种已知微生物的标准图谱进行比对，从而完成对微生物的鉴定。

而直至目前，临床实验室仍然非常依赖传统的微生物鉴定方法，耗时长、灵敏度低，远不能满足临床感染性疾病病原体快速诊断的需要。在此基础上，16S rRNA测序、PCR因其快速，精确的优势，对微生物的鉴定起到重要作用，但其操作复杂，价格昂贵〔2,3〕,仍不能满足一般临床微生物鉴定的需求。MALDI-TOF这种技术样品预处理简单，无需对样品预评估，样本的预处理仅需3步(挑选菌落、点样、加入基质)，3 min内即可完成全部的预处理，所需耗材如乙醇、乙腈、甲酸等为常用试剂，成本低廉。其鉴定结果采用得分形式，具有清晰、准确性〔4〕,国内有研究显示鉴定准确率可达到95%以上〔5〕,另有国外学者Nomura〔6〕高度评价其为微生物领域具有革命性的转折。

2MALDI-TOF在微生物领域鉴定的应用

2.1细菌最新研究显示，MALDI-TOF在细菌的鉴定中取得了显著的成效，研究通过将MALDI-TOF与传统全自动微生物鉴定/药敏分析系统 (VITEK 2)比较，不符合的标本再与“金标准”16s rRNA测序方法比较，发现临床常见细菌如葡萄球菌(99.7%)〔5〕、肠杆菌(96.7%)〔7〕、非发酵革兰阴性杆菌(98.75%)〔8〕等的鉴定准确率令人可观。

2.1.1革兰阴性菌2013年Richter等〔7〕研究显示该技术对于绝大多数肠杆菌可鉴定到种水平，但大肠埃希菌和志贺菌仍不能严格区分，需要附加试验加以佐证。MALDI-TOF可准确鉴定鲍曼不动杆菌〔9〕。对于变形杆菌只能鉴定到属水平，无法区分普通变形杆菌与奇异变形杆菌〔5〕。依据目前的数据库，弧菌属(97%)〔10〕、加德纳菌属(97.4%)〔11〕、枸橼酸杆菌属〔7〕、伯克霍尔德菌(100%)〔12〕等鉴定结果准确可靠，已经被用于临床感染性疾病病原体的鉴定。

2.1.2革兰阳性菌目前已有多项研究表明葡萄球菌、肠球菌菌种水平的鉴定准确率近乎100%〔5,7〕，但是，该技术在链球菌的鉴别存在缺陷，对肺炎链球菌与缓症链球菌尚难以区分，需要进一步试验鉴定。其他阳性菌如棒状杆菌属〔13〕、李斯特菌〔14〕、乳酸球菌〔15〕等的鉴定结果准确可靠。

2.1.3厌氧菌近年来，厌氧菌的鉴定在内源性感染性疾病中受到了广泛的关注。随着MALDI-TOF进入微生物实验室在厌氧菌鉴定研究的不断深入，2014年在一项对106份厌氧菌的研究中，MALIDI-TOF与传统技术的鉴定结果一致率可达95.3%〔16〕，另有大量关于其在厌氧菌鉴定方面的应用〔17～19〕,旨在通过低分子量的蛋白质谱，对消化链球菌属、普雷沃菌属、脆弱类杆菌、丙酸杆菌属、乳杆菌属、破伤风梭状芽孢杆菌属的鉴定及临床感染性疾病的诊治提供更有价值的信息。

2.1.4分枝杆菌MALDI-TOF在鉴定分枝杆菌时，需通过特殊的蛋白提取步骤，更为有效的蛋白萃取方法，进而建立分枝杆菌蛋白标记物的数据库，对大多数分枝杆菌的鉴定起到关键作用。2015年Tudo等〔20〕研究显示，在结核杆菌方面，该技术仍不能鉴定到菌种水平，除一些亲缘关系密切的菌种，如鸟分枝杆菌与胞内分枝杆菌，偶发分枝杆菌与脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌、胞内分枝杆菌之间难以鉴别，大多数分枝杆菌都能用MALDI-TOF技术鉴别。

2.2真菌在真菌鉴定方面，MALDI-TOF不仅优于传统生化鉴定程序，而且可以区分亲缘关系密切的菌属〔21〕，如白色念珠菌与都柏林念珠菌、近平滑念珠菌(1型、2型、3型)、光滑念珠菌与布拉加念珠菌等。已建立的庞大数据库为MALDI-TOF丝状真菌的鉴定提供了基础，Becker等〔22〕研究显示MALDI-TOF在丝状真菌菌种水平鉴定的精确率达95.4%。此外，De Respinis等〔23〕拓展了皮肤丝状真菌的数据库，其中包含13种菌属与131种菌，在8种菌属鉴定的准确率可达到100%。

2.3病毒在感染性疾病中，病毒因其严格细胞内寄生，分离培养较困难，需时很长，且有些病毒至今仍不能培养，需采取快速诊断的方法得以鉴定，而MALDI-TOF凭借其高通量、周期短的优势逐渐在临床病毒学领域扮演重要角色。Calderaro等〔24〕通过检测脊髓灰质炎病毒特异蛋白(VP)从而鉴定感染细胞和非感染细胞,并且联合应用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯化蛋白质以提高对脊髓灰质炎病毒检测的敏感性和特异性，节省了核酸分析的时间，为疾病的治疗争分夺秒。此外MALDI-TOF在病毒检测方面不仅与传统技术具有较高的一致性〔25〕，同时在大规模流行病学研究方面具有较大的潜能〔25〕。

2.4耐药菌株除鉴定正常的微生物菌群外，MALDI-TOF也被用于耐药菌株的鉴定。Du等〔26〕早期研究发现MALDI-TOF可以将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)与甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)区分开来。Luo等〔5〕、Kempf等〔27〕研究证实MALDI-TOF在检测产碳青霉烯酶尤其是内酰胺酶方面具有特异度高、准确度高的优势。Li等〔28〕通过检测头孢噻肟与69株G-菌孵育后水解产物的量，表明MALDI-TOF在检测超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的G-菌中具有潜在的临床价值，今后可在临床微生物实验室广泛开展。2014年Lange 等〔29〕通过采用MALDI-TOF成功鉴定耐美罗培南的肺炎克雷伯杆菌，准确度达97.3%，特异度达93.5%。然而，因肠球菌(如粪肠球菌和屎肠球菌)，肠杆菌(如大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌)这些菌株所得的耐药菌株与正常菌株的质谱图没有明显差异，所以该技术尚不能对该菌株耐药性做出准确的鉴定。

3MALDI-TOF的局限性

首先，MALDI-TOF数据库仍需不断完善，对于一些稀有菌种和亲缘关系紧密的菌株(大肠埃希菌与志贺菌)的鉴定容易造成误差〔7〕。同时，MALDI-TOF目前尚不能为某个特定菌种设定一个具体分离该菌的阈值；当样品含多个菌种时，MALDI-TOF只能区分到亚种水平，且当某一菌种数量占据绝对主导地位时，MALDI-TOF分离和鉴定会受到明显限制。再者，MALDI-TOF鉴定血培养阳性菌属时，血液中的血红蛋白、白蛋白会干扰质谱信息，因此必须提前对样本进行额外的净化处理〔18〕。另外，MALDI-TOF虽然可以成功鉴定产碳青霉烯酶耐药菌株，但对于其他细菌及真菌耐药机制的研究尚不明确。此外，靶板点样，涂布均一性，菌株本身生长速度，这些因素都会影响检测的敏感性、可靠性，值得我们进一步研究。从理论上讲，MALDI-TOF可以直接鉴定血液、尿液、脑脊液等体液中的病原微生物，但实践中发现这些体液中可能含有非蛋白物质，会对蛋白质谱信息产生一定的干扰。因此，通过优化样本提取或萃取步骤，MALDI-TOF有望成为更为高效的微生物鉴定方法。

4展望

MALDI-TOF是一项快速、简洁、准确鉴定病原微生物的新型技术，如能将MALDI-TOF用于鉴定微生物毒素蛋白，我们就可以借此了解微生物的致病因素，对于新型爆发菌株的致病性研究具有很大的意义。随着质谱数据库及操作规程不断完善和规范化，MALDI-TOF的方法必将成为临床微生物鉴定的重要工具，为临床感染性疾病的诊治提供巨大帮助。

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〔2015-12-20修回〕

(编辑李相军)

通讯作者：许建成(1976-)，男，副教授，副主任医师，主要从事细菌耐药机制的研究。

〔中图分类号〕R37

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)13-3336-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.118

1吉林大学第一医院神经肿瘤外科

第一作者：李欣(1990-)，女，硕士在读，主要从事临床微生物学研究。