西尼罗病毒血清学检测技术研究进展

崔新国，郭晓芳，2，周红宁,2



西尼罗病毒血清学检测技术研究进展

崔新国1，郭晓芳1，2，周红宁1,2

西尼罗热(West Nile Fever, WNF)是由西尼罗病毒(West Nile Virus, WNV)感染引起经蚊虫叮咬传播的一种人兽共患性疾病。WNV在世界上广泛分布，主要分布在欧洲、中东和北美等地。人对WNV普遍易感，WNF临床症状主要包括高热、全身乏力、头痛、肌肉酸痛等，并发神经性疾病致死、致残率高，早期实验室诊断WNV 感染对于患者治疗和防止疫情暴发或扩散具有重要价值。实验室检测WNV技术主要包括血清学试验、病毒分离技术和分子生物学检测技术；其中，血清学检测仍是目前使用最广泛的方法，包括中和试验、酶免疫法、免疫荧光试验、血细胞凝集抑制试验和补体结合试验等。本文就上述常用的WNV 血清学检测技术进行综述。

西尼罗热；血清学；检测

西尼罗热(West Nile Fever, WNF)是由西尼罗病毒(West Nile Virus, WNV)感染引起经蚊子叮咬传播的一种人兽共患性疾病，主要分布在欧洲、中东和北美等地,逐渐成为了目前世界上流行范围最广的虫媒病毒性传染病之一[1-2]。研究发现WNV主要有Ⅰ谱系和Ⅱ谱系2个基因型，其中Ⅰ谱系是目前WNF的主要基因型，广泛分布于欧洲、中东和北美等地；Ⅱ谱系仅在非洲小范围内传播[3-5]。在我国，1988年在云南省洱源县鸟类体内首先检测到WNV血清学阳性[6]。2004年，中国新疆维吾尔自治区发现了94例发热合并神经性疾病，由于患者标本与日本脑炎病毒存在抗体交叉反应而未能得到确诊[7]。2014年杨显超等[8]对上海地区几种动物血清中西尼罗病毒抗体的调查显示，马、珍禽、鸭中WNV抗体阳性率较高分别为67.5%、17.9%和23.3%。WNF起病急，临床症状主要包括发烧(>38 ℃)、全身乏力、头痛、肌肉酸痛等，有证据显示20%～25%的WNF患者为轻型症状，0.67%的患者会出现WNV神经性疾病[9-11]。为此，早期诊断WNV感染对于患者预后和防控疫情暴发或扩散具有重要的意义。目前实验室检测WNV技术主要包括血清学检测技术、病毒分离术和分子生物学检测技术。其中，后两者检测技术所需条件、人员、设备要求较高，耗时长，不适合现场检测WNV疑似病例，而血清学检测方法是现今使用最广泛的实验室检测WNV方法,如中和试验(Neutralization Test, NT)、酶免疫法(Enzyme Immunoassay，EIA)、免疫荧光试验(Immuno-fluorescence Assay，IFA)、血细胞凝集抑制试验(Hemagglutination Inhibition Assay，HIA)和补体结合试验(Complement Fixation test，CFT)等。本文对上述常用的WNV血清学检测技术进展做一综述。

1 中和试验

最早的中和试验是采用接种方式将含病毒的样品接种到试验动物或鸡胚/细胞培养，以观察病变情况，但早期中和试验只能初步鉴定出该样品是否具有病毒感染以及较难确定出病毒种类。Simithburn等[12]采用中和试验在乌干达、苏丹、刚果和肯尼亚等国家对当地人群开展WNV抗体滴度调查，发现当地人群WNV抗体水平较高(部分地区超过50%)。Andayi等[13]在东非吉布提市区采用该方法对来自324个家庭的1 045成员进行WNV抗体检测，结果发现WNV抗体阳性率为0.6%。由于早期NT交叉反应高、特异性差等特点，目前已被空斑减少中和试验(Plaque Reduction Neutralization Test，PRNT)替代。Melissa等[14]采用单克隆抗体对传染WNV-NY2000株的BHK-21-15细胞开展PRNT50检测，发现单克隆抗体能够与WNV表面抗原特异性结合，且与其它黄病毒无交叉反应，较适合于检测健康人群先前是否感染过WNV的血清学调查。近年来，Hofmeister[15]采用PRNT观察7周龄北美林鸳鸯感染WNV研究，结果发现感染WNV后的第3 d就能检测到WNV IgM，第5 d检测到WNV IgG，提示WNV病毒血症期短但病毒含量高的特点。此外，Gennaro等[16]采用早期血清中和试验(Serum Neutalization Assay, SN)和PNRT-90两种方法对38份来自克罗地亚的WNV神经性病变病人标本进行 WNV抗体定量比较检测发现，两者方法无显著差异(P>0.05)，但SN省时省力，不需细胞培养，且使用方便，更适合WNV感染的早期诊断。

2 酶联免疫吸附测定法

该方法是以免疫酶技术为基础检测人或动物体液中微量物质的一种新型固相免疫测定技术，是现今测定病毒感染人或动物抗体(IgM/G)应用最广泛的一种检测方法。Escribano-Romero等[17]在塞尔维亚采用ELISA和NT两种方法对279头圈养猪、318头野猪和91只狍感染WNV检测，发现ELISA WNV阳性分别为43(15.4%)、56(17.6%)和17(18.7%)；同时采用NT对ELISA阳性标本验证发现阳性只有6(15.4%)、33(59%)和4(23.5%)，说明ELISA检测WNV特异性低。Kolawole等[18]采用ELISA方法对Ogbomoso地区的城市和农村居民93份血清标本检测WNV的IgM和IgG，结果显示IgG阳性为19.4%，IgM阳性为12.9%；与其它黄病毒的交叉试验阳性率为8.6%，说明ELISA检测WNV抗体敏感性较高，但特异性不强。Medic等[19]采用ELISA和PRNT-90比较检测塞尔维亚北部的7个不同地区马科动物血清中WNV感染情况，共检测252份标本，结果ELISA IgG阳性为72份(28.6%)，但采用WNV-2型病毒株PRNT-90进行验证阳性仅为48份(19.1%)。此外，Vilibic-Cavlek等[20]在克罗地亚西北地区搜集了95份临床疑似感染WNV病人标本，采用ELISA检测其IgM和IgG抗体，并采用NT进一步验证，结果显示26份标本为阳性(27.4%)，但采用NT对ELISA检测阳性标本进行验证仅有20份为阳性，检测吻合率为76.9%。由于WNV的宿主广泛，ELISA检测WNV抗体具有敏感性高，特异性低的特点，与黄病毒具有较高的交叉反应，常需要PRNT进一步验证。近几年来，针对上述ELISA特异性较低的特点，不断研发出了适用WNV检测的ELISA技术，如捕获法ELISA、表位阻断ELISA、竞争法ELISA和生物素微球免疫测定法(b-MIA)等。

2.1 捕获法ELISA 根据检测目标不同分为IgM抗体捕获ELISA(MAC-ELISA)和抗原捕获ELISAs(ACE)。其中IgM应答通常在WNV感染的第1周内才可能检测到，而且IgM在血浆/血清中一般可持续47 d，在CSF中可持续长达100～199 d，甚至在含有病毒血症献血者的血浆或血清中可持续1年[21-22]。Tardei等[23]在罗马尼亚WNV流行期间采用IgG和IgM捕获法ELISA检测290份急性期病人血清/脑脊液中IgG和IgM抗体，结果在发病第1周有37%IgG阴性的血清和25%的IgG阴性的脑脊液中检测到IgM，并且发现WNV IgM抗体在急性期标本中与其它黄病毒之间未出现交叉反应。对于抗原捕获ELISAs(ACE)法用于WNV的检测，Macdonald等[24]研发出两种ACE实验性地用于WNV感染仓鼠的NS1的检测，其中第一种ACE以一种多克隆抗体血清作为检测抗体，第二种ACE使用同种单克隆抗体来捕获和检测NS1抗原，研究发现第一种以重组NS1的ACE较第二种方法的特异性和敏感性均较高。Chung等[25]使用两种不同的单克隆抗体研发出ACE，该方法可检测到 0.5 ng/mL 的NS1，通过交叉反应分析显示该法与DEV和St. Louis EV 之间未有交叉反应,且能有效检测出WNV感染后3 d血浆中的NS1。Divyasha等[26]利用WNV NS-1抗原制备鼠单克隆抗体，采用ELISA对105份兔血清进行检测，并通过RT-PCR进行验证，结果显示该方法的灵敏性为97%，特异性为98%。上述研究提示，捕获法 ELISA检测WNV具有较高的特异性和敏感性，操作简便，较适合现场应用，但MAC-ELISA对急性期样本(感染后3 d)的检测效果较差，这与WNV IgM出现较晚有关。

2.2 表位阻断ELISA 该技术是采用WNV特异性结合的血清和WNV单克隆抗体(MAbs)之间存在竞争为原理而制成，常应用在动物感染WNV的诊断[27]。Sotelo等[28]采用表位阻断ELISA法、病毒中和试验和血凝抑制试验，对来自不同地区的91匹马科动物、87头反刍动物和146只野生鸟类检测，发现表位阻断ELISA法WNV阳性率30.8%，特异性为79.5%～96.5%、敏感性100%；又分别用西班牙/2007-WNV株和摩洛哥/2003-WNV株接种鹧鸪后取不同时间血标本检测，同时进行VNT和表位阻断ELISA比较研究，发现阻断ELISA可以在感染后3 d检测到WNV抗体，而NT则需要在感染后10 d才能检测到；对来自西班牙多尼亚拉国家公园的91匹放养马标本进行表位阻断ELISA和NT检测，示表位阻断ELISA特异性为96.5%，敏感性为100%；对来自南非的236份哺乳动物标本采用表位阻断ELISA和HAI进行比较检测发现，表位阻断ELISA特异性为79%，敏感性为100%，进一步证实了表位阻断ELISA可较好地用于动物感染WNV的诊断。

2.3 竞争法ELISA 其原理类似放射免疫测定。Niczyporuk等[29]采用该方法对2010-2014年波兰42例患脑膜炎或淋巴细胞性脑膜炎病人的血清标本进行WNV抗体检测，结果显示14例病人为阳性(33.33%)，随后采用病毒微量中和试验重复检测后证实，上述阳性标本与JEV群抗原之间存在交叉反应。目前竞争ELISA抑制法有固定的试剂盒，条件要求不高，适合现场操作，但对标本量需求较大。

2.4 生物素微球免疫测定法(b-MIA) 该技术利用亲和素与生物素有较强的非共价亲和作用，结合应用到ELISA技术上，与酶结合的亲和素分子和与特异性抗体结合的生物素分子产生反应，具有酶的放大作用，又有酶和底物的催化显色作用，从而达到检测未知抗原或抗体分子的目的。Balasuriya等[30]利用重组WNV E、NS1、NS3或NS5蛋白开发了4种MIA来测定91份疫苗接种或者天然感染的马血清中的WNV IgG抗体，并通过PRNT进行验证，结果显示重组E蛋白 MIA敏感性为99.3%，特异性为97.4%。Johnson等[31]对美国科罗拉多州CDC搜集的320份MAC-ELISA阳性的WNF病人血清进行MIA对比验证，发现90%检测结果(288/320份)和MAC-ELISA一致，在交叉反应试验中，18份的登革热病人标本仅1例出现交叉反应，说明该方法敏感性高，特异性较强。Johnson等[32]再次于2007年在美国CDC虫媒病毒病司对285份MAC-ELISA阳性的WNF病人血清进行MIA检测，结果显示MIA的吻合率为92%(262/285份)，经过PRNT验证MIA的一致性为100%。MIA价格低，样本量只需MAC-ELISA的1/5，可以在4.5 h内测定血清和脑脊液中的IgM和IgG抗体，且能区分黄病毒的人工免疫和自然感染，以及不同时期的感染，但需要实验室、先进设备和特殊试剂等。

3 免疫荧光技术(IFA)

利用荧光色素不仅能与抗体球蛋白结合，也可以与病毒感染的细胞结合，并可通过显微镜进行观察的原理研发，可用于检测或定位各种抗原和抗体。Niedrig等[33]使用IFA和ELISA在南非人间WNF爆发期间收集的200份血清比较研究，并通过NT进行验证，结果显示，ELISA特异性为99.5%，IFA的特异性为100%。Malan等[34]采用IFA对82份WNV血清和16份脑脊液进行WNV IgG 和IgM检测，并把检测结果与WNV IgG ELISA和Ig M MAC-ELISA结果进行比较，结果发现不仅IgG IFA与IgG ELISA吻合率为92%，敏感性为100%，特异性为90%；IgM IFA与IgM MAC-ELISA吻合率为98%，敏感性为96%，特异性100%，而且认为IFA法在WNV血清学诊断中较ELISA和MAC-ELISA更廉价和敏感。Sanchini等[35]在2011年的第2次WNV感染血清学诊断的外在质量保证(External Quality Assurance, EQA)的研究中，对13份WNV阳性的血清标本采用IFA和ELISA比较检测，ELISA的敏感性IgM为54%，IgG为87%；IFA的敏感性IgM为45%，IgG为86%。但对于WNV谱系Ⅱ，IFA比ELISA更敏感，IgM为91%，IgG为77%。特异性方面ELISA中IgM为94%，IgG为64%；而IFA中IgM为99%，IgG为85%，在IgG的检测中IFA比ELISA更特异(P<0.05)。但该方法比NT特异性差， IgG IFA与其它虫媒病毒有广泛的交叉反应，但IgM IFA则无交叉反应，常用作临床病例的调查[33]。

4 血凝抑制试验(HIA)

该技术为利用抗表面蛋白(E)抑制禽类红细胞聚集的原理研制而成，具有廉价，快速，无种属特异性，不需BSL-3实验室条件，只需抗原制备等优点[36]。Thompson等[37]在特立尼达的动物种群中进行虫媒病毒血清学阳性率调查，采用HIA和表面阻断ELISA方法对58匹当地未接种WNV疫苗的马进行WNV抗体检测，并通过PRNT复核，结果显示HIA11例为WNV抗体阳性，10匹马经HIA检测为阳性(17.2%)，表面阻断ELISA 7例阳性(12.1%)，说明HIA的敏感性比表面阻断ELISA高。Lorono-Pino等[38]在墨西哥尤卡坦州对于2002年7-9月搜集的252匹马标本采用该方法进行WNV抗体筛选，根据标准方法和鹅红细胞进行结合，证实有6匹马感染WNV。Nicolli等[39]在加拿大的Manitoba省的健康科学中心对2003年5-10月的79名肝移植患者血清进行检测发现，20名患者为WNVIgG-EIA阳性，采用HIA对这20份EIA阳性标本验证示只有4份为阳性，又进行NT和RT-PCR进行验证全部为阴性。说明HIA敏感性较ELISA低，特异性较NT低。而且，HIA的检测结果受非特异性抑制剂影响，且与JEV血清复合群和其它黄病毒血清复合群之间存在广泛的交叉反应等限制了该方法的应用[36]。

5 补体结合试验

根据抗原抗体复合物可与补体结合从而消耗掉反应液中已知浓度的补体，以补体消耗的量推测出样本中抗原或抗体的含量，该方法是过去常用的检测方法。Autorino等[40]对于1998年WNV流行的意大利托斯卡纳地区的159匹马采用该方法进行检测，并通过PCR证实有123匹马为WNV阳性(78%)，在12匹患病马的标本中经CFT检测均为WNV阳性，WNV抗体滴度为1∶4～1∶128之间。由于CFT在数据分析和结果判读方面费时费力，在人类感染WNV的诊断中已很少使用[41]。

6 其它血清学检测方法

补体依赖的细胞毒(CDC)法，该方法用于检测马血清中WNV NS1抗体的试验发现它可将WNV感染的马从JEV感染的马中区分开来，较好地用于WNV感染的血清学诊断[42]。表面增强拉曼散射(SERS)免疫测定法，该方法利用涂覆有纳米金的WNV E蛋白作为SERS的反应底物和A/G蛋白一起与拉曼标记孔雀绿共轭结合作为双功能的拉曼标记/抗体结合物，将涂覆有纳米金的E蛋白与兔的免疫血清共同孵化后，对夹心免疫复合物进行激光扫描显示出SERS反应信号，通过特征性集束光谱峰在血清中的显示比例能够最低检测出血清中2 ng/mL的抗体，与传统的免疫检测方法相比，它的敏感性是间接ELISA的400倍，可替代传统的ELISA用于哺乳动物WNV感染的检测[43]。膜电化学检测法，该方法通过在纳米多孔氧化铝膜上放置一根感应电极，研制出了一种能够识别病毒颗粒或者病毒E蛋白的基于膜电化学生物传感器，并根据IgM抗E蛋白结构域 III 的特点设计出了用于检测WNV颗粒的特异性生物识别探针。它对于病毒蛋白和全病毒颗粒具有高灵敏性，最低可检测到4 pg/mL，和 2个颗粒/100 mL[44]。该方法需样本量少，能够30 min内完成蛋白质和病毒颗粒的检测，在宿主感染早期具有良好应用前景。

5 结 语

WNV是现今世界上流行范围最广的虫媒病毒之一，严重威胁着人类公共健康，特别是儿童、老年人和免疫功能低下者。针对目前WNF并无特效药物，以支持疗法为主，尚无人用疫苗，预防WNV感染最好的方法仍然是防止蚊子叮咬，同时最近分离到的病毒株通过细胞培养和动物接种显示WNV毒力正在增强[45]。尽管我国近年来在WNV流行病学和临床特征的认识方面有了明显提高，而且在实验室检测方面有新的发展，但WNV在我国属于新发虫媒传染病，迫切需要加大力量研发出新的WNV血清学检测技术，为及时发现WNF输入病例和处置奠定基础。

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Advances in normal serology test for West Nile virus infection

CUI Xin-guo1, GUO Xiao-fang1,2, ZHOU Hong-ning1,2

(1.InstitutionofPathogensandVectors,Pu’erDivision,DaliUniversity,Pu’er665000,China;2.YunnanKeyLaboratoryofArborInfectiousDiseasesPreventionandControlResearch/YunnanPublicHealthCoordinationandInnovationCenterandYunnanArbor-virusResearchCenterofYunnanInstitutionofParasiticDiseases,Pu’er665000,China)

West Nile fever (WNF) is a zoonotic disease which caused by West Nile virus (WNV) and transmitted by mosquitoes. WNV is widely distributed in the world such as Europe, the Middle Eastern, the North America and the other regions. Human are generally susceptible to WNV, its clinical symptoms mainly include high fever, malaise, headache, muscle pains, etc. If patient was complicated by neurological disease, the rate of mortality and disability could be high. Therefore, it is important to early diagnosis WNV infection for the patient treatment and prevention to prevent from its epidemic outbreak and spread. The technologies of laboratory test WNV include serology, viral isolation and molecular biology test, of those WNV serological test is still most important and widely used method, including neutralization test (NT), enzyme immunoassay (EIA), immuno-fluorescence assay (IFA), hemagglutination inhibition assay (HIA) and complement fixation test (CFT), etc.

West Nile fever; serological; test

Zhou Hong-ning, Email: zhouhn66@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.014

云南公共卫生与疾病防控协同创新中心项目(No.2014YNPHXT03)，国家自然科学基金项目(No.81160357,30960327,30660160)，中英学者基金资助项目(Sino-British fellowship trust in UK，313669)

周红宁，Email：zhouhn66@163.com

1.大理大学病原与生物媒介研究所(普洱分部)，普洱 665000；

2.云南省虫媒传染病防控研究重点实验室，云南省公共卫生协同创新中心，云南省虫媒病毒研究中心，云南省寄生虫病防治所，普洱 665000

R373.9

A

1002-2694(2016)10-0922-06

2016-04-18；

2016-08-16

Supported by the Incubate projects of Yunnan Public Health and Disease Control-Prevention Collaborative Innovation Center (No. 2014YNPHXT03), the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81160357, 30960327, 30660160), and the Program of Sino-British Fellowship Trust in UK (No. 313669)